小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及基因表达量研究摘要：为研究小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及其基因表达量变化，以山农17为试验材料,测定了不同温度条件下萌发的小麦种子中的淀粉、可溶性糖含量及相关酶（淀粉酶和淀粉磷酸化酶）活性，并采用实时荧光定量PCR技术测定各酶相关基因相对表达量。结果显示,不同温度条件下萌发的小麦种子，淀粉含量随萌发进程以不同的速率呈下降趋势，可溶性糖含量呈先下降后上升趋势，a-淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性和呼吸速率整体呈上升趋势，以上各指标均在露白前后有明显的变化；B-淀粉酶呈现双峰变化趋势，且一直保持较高活性；a・淀粉酶和淀粉磷酸化酶基因的相对表达量均呈上升趋势，且与酶活性呈极显著相关。以上结果表明，在小麦种子萌发早期，温度能强烈影响萌发过程中淀粉降解关键酶基因的表达量;a-淀粉酶和淀粉磷酸化酶在种子置床初期即可被检测到活性，且受其编码基因的调控作用显著，在种子萌发过程中具有重要作用。关键词：淀粉代谢；淀粉酶；淀粉磷酸化酶；荧光定量PCR；基因表达---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号:1001-4942(2014)09-0039-07萌发是植物生长发育的前提，关系到作物后续生长，乃至最终产量［1］。影响种子正常萌发的因素很多,包括内部生理条件和外部环境条件，其中，温度强烈影响萌发种子内部酶活性和物质代谢，进而影响发芽率和萌发速率［2］。目前，对种子萌发代谢的研究已从传统的生理生化水平深入到基因组及蛋白质组水平⑶。但诸类深层次的研究大多集中于大麦、番茄以及模式植物拟南芥,且主要针对种子萌发后期的代谢变化，对萌发初期的研究甚少［4,5］0Weitbrecht等⑹指出对种子萌发早期(介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间)内部代谢事件进行研究，对于完善种子萌发的机理具有重要意义。淀粉降解是小麦种子萌发过程中主要的物质代谢，其代谢产物为种子萌发提供必需的养料和能量⑺。关于淀粉降解及其相关酶的研究已有诸多报道⑻。然而,在基因水平层面的研究多集中在种子发育过程中的淀粉合成部分［9,10］,对萌发过程中淀粉降解关键酶基因表达量的研究不多。因此，本研究以当地小麦品种山农17为试验材料，测定了不同温度条件下萌发早期（介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间）淀粉和可溶性糖含量、淀粉降解关键酶活性及其基因相对表达量变化，旨在探究种子萌发早期淀粉降解的酶学变化和基因转---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---录调节变化，以期为进一步阐明小麦种子萌发机理提供基础数据。1材料与方法1.1材料与设计以小麦品种山农17为试验材料，2012年收获于山东农业大学试验站。发芽共设置3个温度处理（最适温度20°C、高温30°C.低温10°C）o取样时间分布在萌发前、露白至发芽三个阶段。具体取样时间：30°C下萌发的种子每隔4h取样；20°C和10°C条件下萌发的种子每隔8h取样，直到发芽结束（胚芽长度为种子一半）时停止取样。此外，20°C和10°C条件下，在露白时各增加一次取样（20°C、12h,10°C>40h）o发芽前将种子含水量调整到12.5%（以减少种子本身对结果造成的差异），用5%H2O2消毒2〜3min,再用去离子水冲洗5〜6遍后选取100粒籽粒饱满、大小均一的种子，整齐的摆放到发芽盒，放入培养箱培养，每天适量补水并按时取样。重复3次。用于RNA提取的材料保存于液氮中，用于酶活性测定的材料液氮速冻后放入・20°C冰箱中备用1.2试验方法1.2.1测定方法淀粉含量参考双波长法测定□［］；B■淀粉酶及总淀粉酶活性参考3,5■二硝基水杨酸法---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---可溶性糖含量采用蔥酮比色法测定［22］；a■淀粉酶、测定［13］；淀粉磷酸化酶活性采用无机磷释放定量分析法测定［14］。1.2.2小麦籽粒总RNA的提取、质量检测及反转录总RNA的提取、质量检测参考李浩等的方法［15］oCDNA合成按照宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）反转录试剂盒说明书进行，反转录后的cDNA保存于・20°C冰箱备用01.2.3荧光定量PC...