薯蓣皂苷抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制研究杨美雅(温州医科大学附属第三医院<瑞安市人民医院>325200)【摘要】目的：研究薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)抑制人结肠癌细胞增殖的作用及机制。方法：采用人结直肠癌细胞SW480、SW620、RKO和Caco-2,MTT和集落克隆实验分析Dio对细胞生长、增殖的影响；流式细胞术检测Dio干预对细胞凋亡的影响，Westernblot法检测Dio干预后细胞凋亡执行蛋白表达的变化。结果：与空白对照组相比，Dio呈剂量依赖抑制人结直肠癌细胞SW480、SW620、RKO和Caco-2的生长，IC50剂量干预细胞显著减少克隆数；IC50剂量的Dio干预24h，SW620和RKO细胞凋亡率分别由8.3%&plusmn;4.2%、10.7%&plusmn;6.4%上升至62.6%&plusmn;6.3%和53.2%&plusmn;7.5%，凋亡执行蛋白cleavedcaspase3和cleavedPARP表达显著上调。结论：Dio具有抑制结直肠癌细胞增殖的作用效应，诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。【关键词】薯蓣皂苷；结直肠癌；增殖；凋亡【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2015)13-0099-03结直肠癌(ColorectalCarcinoma,CRC)居我国恶性肿瘤发病率的第四位，且新发病例逐年显著增加［1］。因多数患者确诊时已处于中晚期，手术治疗已无法彻底清除病灶，放化疗仍是结直肠癌主要的治疗手段；但当前化疗方案存在客观反应率低、疗效差、毒副反应严重等问题［2,3］。因此，从传统药材提取寻找高效低毒的活性成分杀伤结肠癌细胞以改善患者的预后只有重要意义。薯賴皂苷(Dioscin，Dio)是甾体总皂苷的一种，提取自薯賴科植物(DioscoreapolystachyaTurcz.)［4］0中医学认为薯蓣科植物只有“活血舒筋、消食利水、祛痰和截疟”等功效［5］。研宄发现其活性成分Dio只有抗肿瘤、改善心血管功能、调节免疫、降血脂等多种药理作用［4］。木研究以体外培养的人结肠癌细胞为研宄对象，观察Dio对细胞生长的影响，并分析Dio干预对肿瘤细胞凋亡和凋亡执行蛋白cleavedcaspase3和cleavedPARP表达的影响，探讨Dio抑制人结肠癌细胞增殖的作用及机制。1•材料1.1药物和细胞株薯蓣皂苷购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度&ge;98%）;用DMSO配成50mmol?L-l的母液，-20°C保存，应用时用培养液稀释至B标浓度。人结直肠癌细胞株SW480、SW620、RKO和Caco-2购自中国科学院细胞库。1.2试剂胎牛血清、高糖DMEM培养液、0.25%胰酶-0.02%EDTA购自Gibco公司；噻唑蓝（MTT）购自Amersco公司;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自BDPharmingen公司；兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-PARP和GAPDH多克隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体均购自为CellSignalingTechnology公司产品；ECL化学发光试剂购自BIO-RAD公司。1.3主要仪器细胞培养箱（Thermo公司），iMARK酶标仪（Bio-Rad公司），CantoII流式细胞仪（BD公司），垂直电泳及蛋白转膜装置（BIO-RAD公司），凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。2.实验方法2.1细胞培养SW480、SW620、RKO和Caco-2细胞以含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养液，培养于37°C、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。2.2MTT分析Dio的细胞毒作用细胞按每孔l&times;104个接种于96孔培养板，细胞贴壁后弃去上清，加入100&mu;L含0.5、1、2.5、5、7.5和10&mu;mol?L-lDio的含药培养液，每组设3个复孔，空白对照组加入等体积的完全培养液。药物作用24h,MTT法分析Dio对细胞增殖的影响，酶标仪测定各孔490nm处吸光度值（A）,计算细胞存活率(％)和半数抑制浓度(IC50),实验重复3次。IC50分析软件计算Dio对不冋细胞的IC50。2.3集落克隆SW620和RKO细胞以每孔2&times;104个细胞接种于6孔板。细胞贴壁后，实验组加入IC50浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液，置于细胞培养箱中培养7d;4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.1%结晶紫染色lOmin，观察各组细胞集落形成的情况。2.4流式细胞术检测凋亡率SW620和RKO细胞以每孔3&times;105个细胞接种于6孔板。细胞贴壁后,实验组加入IC50浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液，Dio作用24h后收集各组细胞，PBS洗涤2次，l&times;结合缓冲液重悬细胞。取100&mu;L细胞悬液加入5&mu;LAnnexinV-FITC和5&mu;LPI,混匀，室温避...