绿色荧光蛋白作为标记蛋白在胰岛素表达的初步研究吴宇娟荣曦张君周秋利刘红(通讯作者)(广西医科大学第一附属医院老年内分泌科广西南宁530021)【摘要】目的探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性。方法构建重组质粒prlnslEGFP,转染HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞，随机分为3组，低糖组(LG)、中糖组(MG),高糖组(HG),检测基线0小时及葡萄糖刺激后4小时内胰岛素分泌量及单个胰ftbeta;细胞荧光强度。结果HG组单个胰岛beta;细胞荧光强度，胰岛素分泌量较LG组明显增强(P<0.05),在一定葡萄糖浓度范围内，绿色荧光蛋白其荧光强度随着葡萄糖浓度的升高而升高，并与细胞胰岛素分泌量呈明显的正相关，相关系数R为0.896o(P<0.05)结论绿色荧光蛋白作为分子标记物其荧光强度与胰岛素分泌量有正相关性。【关键词】绿色荧光蛋白细胞转染相关性胰岛素【】R39【文献标识码】A【】2095-1752(2014)07-0157-02细胞作为牛命体结构基木单元，要了解一些牛命活动规律，就须以细胞为研究基础，要对单细胞进行分析，可引入荧光标记蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是近年来在牛物化学和细胞牛物学中应用最广泛的标记蛋白之一⑴，常被用于研究单个细胞的蛋白表达或者转染后基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在牛物体内定位和转运等[2],免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和CAMP水平的指示，荧光关联谱学、细胞分类选择和细胞系分析，细胞间隙pH变化的检测[3],用于研究转染后基因的表达，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量检测，可对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测⑷，该方法简单有效。但应用中仍有问题亟待解决，荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，目前通过检测绿色荧光蛋白的荧光强度来定量检测转染后单个细胞内蛋白质的量仍无明确报道。为进一步探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性，本实---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---验用重组质粒prlnslEGFP转染HIT-T15细胞后，在荧光显微镜下连续4小时实时监测单个胰岛细胞的荧光强度情况。材料与方法一、实验材料HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞（美国ATCC细胞库），Lipofeltamine2000（inventrogen）,重组质粒prlnslEGFP,免疫组化试剂盒，1640培养基、胎牛血清（GIBC0公司）；荧光显微镜（Olmpus），恒温灌流系统，二氧化碳恒温细胞培养箱（HERAUESEKType）；孔板。二、实验方法2.1瞬吋转染以细胞密度为l106/mL种于24孔板内。加入含10%胎牛血清、lmmol/l的L■谷氨酰胺的1640培养基，恒温培养箱中培养24h。转染前2h把孔板中的培养基换成无血清无双抗的基础培养基，将重组质粒prlnslEGFP2uL和LipofectaminTM20002mu;L分别溶解在48uL培养基中制成转染液，室温孵育5分钟后混匀，再孵育20min,转染24孔板，6h后换普通培养基，20h可观察荧光。2.2实验分组：分为三组：低糖组（LG）含糖2.8mmol/L,中糖组（MG）含糖5・6mmol/L,高糖组（HG）含糖16.7mmol/Lo2.3本实验为保证细胞活性,引用恒温灌流系统（LiveCellMicroscopyEnvironmentalControlSystems）,该设备包含二氧化碳泵,恒温加热皿，加热探头及微量灌流泵等，可保证细胞在37°C,5%CO2及持续微量的培养基灌流的环境下生存。2.4荧光强度的测定葡萄糖刺激后，固定视野，用荧光显微镜连续4小时（间隔0・5h拍1张）拍照，用NIS-ELEMENTSViewer软件分析荧光强度。2.5膜岛素释放量的测定各组细胞予葡萄糖刺激后间隔lh收集细胞孵育液，・20°C保存。用化学---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---发光试剂盒测定培养液中胰岛素浓度。三、统计学分析用SPSS16.0软件分析。数据以均数plusmn;标准差(x・plusmn;s)表示。多组间比较应用多因素方差分析。荧光强度与胰岛素分泌量的相关性分析，两组间均数比较采用SNK,P《0.05为差异有统计学意义。四、结果1、糖刺激后荧光强度测定糖刺激后，低糖组随刺激吋间延长，荧光强度无明显改变(P>0.05)o高糖组较低糖组荧光强度明显增高，差异有统计学意义(P《0.05),高糖组荧光强度随时间延长而逐渐变亮，约在糖刺激后2.5h左右达峰值。...