融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外增殖效应的研究口光明I万小平1杨璐一，高荣*（I川川人学生命科学学院，生物资源与生态环境教冇部重点实验室，川川省动物疫病防治和食品安全重点实验室，成都，610064）摘要：为探索融合抗菌肽MAPWA和PGBD・2在体外的抗病毒作用，特开展以下研究：用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2与Marc・145细胞和PRRSV共培养，以实时定MRT-PCR技术检测Marc-145细胞中及培养液的PRRSV含量。结果发现：PRRSV感染Marc-145细胞96小时，实验纽的RT-PCR检测数量均W1.7,而阳性对照纽的RT-PCR检测数量达到3.38。实验组数值显著低于阳性对照纟R。说明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2能够显著减少PRRSV在Marc-145细胞的复制量；证明触合抗菌肽MAPWA和PGBD-2具有明显的抗病毒效应，能显著地抑制病毒复制，减少其在靶细胞中的含量。提示：融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2分子具有显著抑制PRRSV在靶细胞內复制的作用，为开发抗病毒新型生物饲料添加剂提供了重要的参考。关键词：猪繁殖呼吸综合征病毒，融合抗菌肽，病毒复制前吞猪繁殖与呼吸综合征PRRS（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变界毒株引起的一种急性高致死性传染病，该病既能垂直传染乂能水平传播，能够引起妊娠母猪流产、早产、死产、木乃伊胎、弱仔等，仔猪感染后发病率可达100%,死亡率对达50%以上冋。给我国养猪业的持续发展带来了严重威胁〔铁研究发现，PRRSV病毒为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属⑸，有类似人感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的症状，被称为动物的HIV⑹。口前对PRRSV还没有特效治疗药物，主要采取以预防为主对症治疗为辅的策略。因此，开发和研制出新型药物来治疗该病具有广阔的前景。抗菌肽是牛物机体防御系统产牛的对抗外界病原体感染的肽类活性物质,广泛存在于从原核生物到人类的生物体中⑺。本实验通过采用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2与Marc-145细胞和PRRSV共培养，探索融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2对PRRSV在Marc-145细胞的增殖影响，在细胞水平上检测具对PRRS病毒的抑制作用，为进一步的动物试验提供参考和依据。#：共同笫一作者:白光明（1985・），男，硕士。研究方向：神经肽类的生物学效应E-mail：531437493@qq；万小平（1987-）,男，陳士。研究方向：抗菌肽的作用机理*：通讯联系作者：高荣，教授，博士生导师，E-mail：lake96@qqE-mail：229499677@qq；1材料和试剂1」融合抗菌肽MAPWA(P1)和PGBD-2(P2)基因工程酵母菌发酵上清液和MAPWA、PGBD-2酵母细胞裂解液：成都市金芝源牛•物技术有限公司提供；1.2Marc-145细胞：本实验室保存;1.31640RPMI细胞培养基：Sigma公司生产；1.4PRRSV：王红宁教授和周英顺酋上提供。2实验方法2.1Marc-145细胞的培养从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37°C水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液,移加到离心管中并添加10倍以上的DMEM培养基,混匀；1000-1500r/min,离心5min；弃去上淸液，加入含10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，置37°C、5%CO2环境静置培养；次日更换一次培养液，继续培养。待细胞贴壁生长成致密单层后即对进行传代培养。2.2PRRSV感染Marc-145细胞培养液调节细胞悬液浓度为lxlO6/mL接种于12孔板中，ImL/孔。按照顺序在12孔板中分别添加MAPWA基因丄程酵母菌发酵上清液(P1-1).酵母细胞裂解分子(P1・2)、PGBD・2基因工程酵母菌发酵上清液(P2-1)和酵母细胞裂解分子(P2・2)20pL以及猪繁殖与呼吸综合征病售(PRRSV)液5pL,最后将各孔细胞培养液体积补充到2mL,置于37°C,5%CO2恒温培养箱中培养。同时将空的Marc-145细胞与PRRSV共培养的设为阳性对照组。空的Marc-145细胞为阴性对照纽。逐H观察细胞病变情况，在细胞培养24、48、72、96h时收集细胞备用。2.3实时定量RT-PCR检测PRRSV在Marc-145细胞复制的变化2.3.1Marc-145细胞RNA提取以及反转录参考RNAiso(Takara公司)试剂说明书提取收集细胞的RNA反转录：釆用天根(TianGen)公司cDNA第一链合成试剂盒,20ul体系。37°C1小时。2.3.2RealtimePCR在NCBI上查找出PRRSV的基因序列，由Invitrogen公司设计并合成病...