低温碱性蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学性质研究石慧莫晨阳金喆昊---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---[摘要]本研究从学院食堂附近的土样、人工湖水样和鲫鱼、鲶鱼的肠道中分离得到6株产蛋白酶菌株。经摇瓶发酵复筛后，选择产酶活高的菌株2、菌株5和菌株6进行形态学观察、生理生化鉴定和部分酶学性质研究。结果表明菌株2可能为短短芽孢杆菌，菌株5可能为苏云金芽孢杆菌，菌株6可能为地衣芽孢杆菌。研究3株菌所产蛋白酶的最适pH，发现2号、5号和6号菌株的最适pH分别为6.0、8.0和10.0。菌株5和菌株6所产蛋白酶在pH为8.0～10.0的缓冲液中处理30min后活性几乎不变，在碱性环境中均具有较好的稳定性。菌株5---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---和菌株6所产蛋白酶的最适反应温度均为30℃，低于30℃处理30min活性几乎不变;50℃处理30min后，菌株5和菌株6的残余酶活分别20%和40%。[关键词]低温碱性蛋白酶;芽孢杆菌;筛选;鉴定;酶学性质：Q78;Q55：ADOI：10.16465/j.gste431252ts.202001低温碱性蛋白酶通常指在pH为碱性条件下，0℃～30℃内催化效率较高，对热相对不稳定的一类蛋白酶[1]。低温碱性蛋白酶主要由嗜低温菌和耐低温菌产生[2]，包括假单胞杆菌属、芽孢杆菌属和黄杆菌属等[3]。多数微生物的碱性蛋白酶还具有水解酯键、酰胺键、转酯和转肽的能力，因此被用于植物蛋白加工行业，特别是用于大豆蛋白的降解，增加其营养效价[4-5]。目前，食品、水产饲料、洗涤剂行业和化妆品行业所用的蛋白酶主要是中温碱性蛋白酶，其最适作用温度通常为50℃～70℃。而这些产品的使用温度在发展中国家通常在40℃以下，低温碱性蛋白酶在这些产品中替代中温碱性蛋白酶具有巨大的优越性[6-8]，具有广阔的应用前景。本研究筛选的几株低温碱性蛋白酶芽孢杆菌均具有较强的酶活，具有一定研究价值。1材料与方法1.1材料样品：武汉设计工程学院食堂后土样、武汉设计工程学院人工湖水样、鲫鱼肠道、鲶鱼肠道。初筛培养基：干酪素4.0g，KH2PO40.36g，Na2HPO4·7H2O1.07g，NaCl0.16g，CaCl2·2H2O0.002g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO4·7H2O0.002g，胰蛋白胨0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0～7.2。发酵培养基：蛋白胨0.5%，干酪素0.8%，酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，氯化钠0.58%，柠檬酸三钠0.45%，琼脂2%，pH为8.0。1.2方法---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.2.1產蛋白酶细菌的初筛称样品10g稀释至10-5，取0.1mL10-5稀释液涂布在初筛培养基平板上，30℃恒温培养36h后，观察长出的菌落周围酪蛋白水解圈产生的情况，挑取酪蛋白水解圈较大的菌落，划线分离纯培养并保存。1.2.2产蛋白酶细菌初酶液的制备将筛选的细菌以5%的接种量接种于发酵培养基中，180r/min，28℃摇瓶培养36h，8000r/min离心20min，取上清液，用细菌过滤器过滤除去残余的菌体，获得各菌株发酵液的无菌上清液即为粗酶液。1.2.3碱性蛋白酶活力的测定碱性蛋白酶活的测定方法参考陈琳[7]的《产低温蛋白酶菌株Halomonassp.SD-02的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究》，酶活力单位定义参照《酶制剂工业》[9]。1.2.4产碱性蛋白酶细菌的复筛用1.2.2中方法制备粗酶液，1.2.3法测定各菌株粗酶液的碱性蛋白酶活力，粗酶液和酪蛋白均用0.1MNa2CO3/NaHCO3（pH=10.0）缓冲液稀释或溶解。选择碱性蛋白酶活力相对高的菌株为供试菌株。1.2.5产碱性蛋白酶细菌的鉴定1.2.5.1产碱性蛋白酶细菌的形态鉴定10×100放大倍数下观察用碱性复红染色的菌株的形态、大小、芽孢的着生位置等并拍照;观察菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态并拍照。1.2.5.2产碱性蛋白酶细菌的生理生化鉴定各菌株的生理生化鉴定项目见表2。1.2.6菌株所产碱性蛋白酶的最适作用pH的测定---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---将1.2.3中酶促反应的pH分别用柠檬酸盐/磷酸、磷酸缓冲液、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液调节为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，测定各菌株的粗酶液在不同酶促反应pH中的蛋白酶活力。1.2.7各菌株所产的碱性蛋白酶...