应用实时荧光定量RT-PCR检测急性粒细胞白血病患者AML1ET0融合基因的临床意义分析李海凤(黑龙江省鹤岗市岭北人民医院检验科154101}【屮图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)4-0215-03A前Q血病主要治疗原则是使患者获得尽可能长的完全缓解期，但仍有很多患者达到缓解后会出现复发，这是临床治疗白血病的最人难题之一，这也说明丫现在采用的治疗方法并不能完全的汆死患者体内的异常细胞，临床上把这种状态称为微小残留状态或微小残留病(MRD)，即患者经治疗后，即使达到临床和血液学完全缓解，体内仍有106〜108个残留白血病细胞，这些残留的白血病细胞就成/复发的主要根源。因此能够准确的检测MRD将有助于反映患者体内&血病细胞负荷，初步评价治疗效果，估计患者复发危险度。现在检测MRD的技术敏感性、特异性和可重复性相对较高的是实时荧光定量PCR,但是此方法的标准品建立是成功的关键。本研究通过构建AML1/ETO融合棊因的RNA标准品，并以此融合棊因为标志物，利用RQ-RT-PCR对急性粒细胞白血病M2亚型患者的MRD进行监测，进而探讨此方法临床应用价值。1材料与方法1.1病例收集2007年〜2010年到我院就诊患者的骨髓及外周血标本,37例患者根据FAB分型均为急性粒细胞白血病M2亚型，其屮男17例，女20例，男女比例0.85:1，年龄从16岁到80岁，屮位年龄为50岁。骨髓及外周血共55份标本，其中初诊25份，复发6份，缓解11份，部分缓解2份。1.2试剂引物合成、RNAPCR(AMV)Ver.3.0、RNALAPCRTMKit(AMV)Ver.l.l、质粒PMD-18T、大肠杆菌感受态细胞jM-109、反转录试剂和PCR试剂均为人连宝生物工程公司产品；管家基因ABL的标准品：本实验室保存，详细方法参见参考文献。1.3方法1.3.1RNA标准品构建⑴总RNA提取:分别取9例患者骨髓1ml分离申个核细胞，提取总RNA,应用酚/氯仿/异戊醇精制，具体方法参见TaKaRaRNAiso说明书。引物设计：利用OligoTMPrimerAnalysis软件在人急性粒细胞白血病M2的AML1/ETO基因序列上设计构建引物与定量引物，并在构建上游引物的5′端加上T7启动子，构建用下游引物的5′端加上25个T，使构建的AML1-ETO基因标准品RNA有POIy(A｝尾。RT-PCR：依照TaKaRaRNALAPCRTMKit(AMV)Vet.l.l试剂盒说明书进行操作，逆转录体系为10μl,其中含模板0.5μl,反应条件为30°Cl0min,42°C30min,99°C5min,5°C5min。PCR反应体系为50μl，以10μl逆转录产物作为模板，反应条件为94°C预变性2min，94°C变性30sec，55°C退火30see，72°C延伸1.5min，共循环28次，然后72%延伸3min，反应结束取5μl进行琼脂糖凝胶电泳。0的基因AMLI/ETO标准品构建及鉴定:根据电泳结果(长度为402bp)确定阳性的样本，冋收目的片段，与质粒PMD-18T连接。连接产物热转化入大肠杆菌感受态细胞jM-109中，37"C摇床孵育1小吋，涂布于MX筛选平板，37°C过夜培养。用挑取阳性单个菌落，移入EP管中，99°Clmin,释放质粒。以质粒为模板，BaeBESTrMSequencingPrimerRV-M和BaeBESTrlVISequencingPrimerM13-47为引物进行PCR反应，反应体系为(10μl):引物各0.25μl，dNTP混合液4μl,10×LAPCR缓冲液2.5μl,LATaq聚合酶0.25μl,dH2O2.85μlo反应条件为:94°C预变性lmin，98°C变性lOsec，55°C退火30sec，72°C延伸2min,共30个循环，反应结束取8μl进行电泳。挑取转化成功的质粒对应的阳性菌落放入333培养基，37°C过夜培养。从菌体中提取质粒交大连宝生物工程公司进行DNA测序。对测序结果正确的质粒用Hindlll酶切。用体外转录试剂处理酶切产物，反应体系(20μl):酶切产物10×T7缓冲液2μl,NTP混合液8μl,lnhibitor(40U/μl)0.25μl,17Poly聚合酶2μl,DEPC6.75μlo42°C反应2〜3小吋，得到转录产物，转录产物直接加入50UDNasel(RNaseFree)，37°C处理3小时，电泳确认，根据电泳结果测定吸光度(A)值，根据阿佛加德罗常数(6.023×1023分子数/tOOl)换算为分子拷災数，按1012拷浓度，-80°C保存。RNA标准品反应性能进行检测：将RNA标准品梯度稀释(108、107、106、105、104、103、102、101拷W/μl)作为模板进行实时荧光定量PCR反应，制作标准曲线。为了检测...