EBER原位杂交结果的稳定性与变性温度的研究(皖南医学院弋矶山医院病理科芜湖241001)【摘要】目的:探讨原位杂交变性温度的改变对EBER阳性表达的影响。方法：采用不同变性温度对多例EBER阳性表达的标木进行原位杂交检测。结果:A组50°C:整体几乎阴性，几张微弱阳性，B组55°C:阳性较A组多，强度不稳，整体不均一，C组60°C:基木阳性，强度较强，有几例强度偏弱，D组70°C:全部阳性，强度强，稳定，均一。E组75°C:全部阳性，强度强，背景增强，假阳性率高，特异性降低。结论：原位杂交检测EBER阳性表达在一定范围里随变性温度升高信号稳定性增强，70°C为最佳变性温度。【关键词】原位杂交；EBER；温度【中图分类号】R3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2015)35-0375-02StudyonthestabilityofEBERinsituhybridizationandthetemperatureofthemodifiedLIjiajia,XUGuoxiang,HELei,MEIJingjing,ZHANGWei-uan,CHENGJiao(Departmentofpathology,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu,China,241001)【Abstract】Objective:ToinvestigatetheeffectofthechangeofthetemperatureoftheinsituhybridizationonEBERexpression.Method:InsituhybridizationdetectionwasperformedbyusingdifferenttemperaturetodetectthepositiveexpressionofEBER.Result:Agroupof50°C:almostthewholenegative,aweaklypositive,Bgroup55°C:comparedwiththepositivegroupamulti,intensityisunstable,asawholeisnotuniform,andgroupC60°C:wasbasicallyandstrongintensity,afewcasesofstrengthweak,groupD70°C:allpositive,strength,strong,stable,uniform.TheEgroupwas75°C,allpositive,strongintensity,backgroundenhancement,highfalsepositiverate,specificitydecreased.Conclusion:InsituhybridizationdetectionofEBERpositiveexpressioninacertainrange,withtheincreaseofthetemperatureofthemodifiedsignalstabilityenhancement,70°Cfortheoptimumtemperatureofdenaturation.【Keywords]Insituhybridization;EBER;temperatureEpstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)非常密切的关系。各家检测EBVDNA的方法均不完全相同，灵敏度也存在差异。原位杂交是比较传统的方法，但用EBV-DNA片段作探针原位杂交的检测灵敏度并不高，而且检测步骤相对繁琐。我们用EBER(Epstein-BarrvirusencodedRNAs)-l作探针原位检测鼻咽癌组织中的EB病毒，获得了满意的效果。1.材料和方法1.1材料1.1.1标本鼻咽部活检组织石蜡包埋切片标本由安徽省皖南医学院附属弋矶山医院病理科提供，共25例，均为近1年内存档检测过阳性标本，按常规福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片(2-4μm厚)，取连续切片标本分别进行显色原位杂交(CISH)染色。1.1.2试剂及辅助材料⑴试剂盒(福建泰普生物公司)包括EBER探针、蛋白酶K、一抗、二抗、HRP聚合物(三抗)、DAB及DAB底物、18×18mm杂交用硅化盖玻片等。(注意：EBER探针-20°C，艽余4°C储存)(2)辅助试剂95%洒精、无水酒精、二甲苯、PBS(PH=7.4)、Harris苏木素、0.5%盐酸酒精、Scott's液、蒸馏水等。1.1.3设备及器材ThermoBrite原位杂交仪、数码温控恒温水浴箱、Eppendorf移液器(1-lOul和10-lOOul各一支)、Eppendorf管、立式染缸、染色架数个，冲洗瓶、湿盒、计吋器、光学显微镜、60°C恒温干燥箱、37°C隔水式恒温孵育箱1.2方法1.2.1组织前处理（1）脱蜡：4ul厚切片粘附在APES处理载玻片上，60〜70°C烘烤l-2h,37°C二甲苯15min×2,无水酒精3min×2,95%酒精3min×2，80%酒精3min×2,蒸馏水冲洗3〜5min。（2）蛋白酶K消化:甩干切片，用滤纸吸去周围多余液体，每片组织滴加l×蛋白酶K工作液（蛋白酶原液与PBS按1:25配成工作液）约50ul。室温孵育5min，蒸馏水冲洗1〜2min,梯度酒精脱水，干燥。1.2.2变性杂交（1）滴加探针：每片组织滴加约10-20UI探针，并加盖玻片，避免气泡，用橡胶水泥封固玻片周围。（2）运行杂交仪程序：将玻片放入杂交仪内，运行程序，A组：50°C变性80min,B组：55°C变性80min,C组：60°C变性80min，D组：70°C变性80min...