一株罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及耐药性分析王辉摘要：从海南省三亚市崖州区养殖的罗非鱼中分离得到一株优势病原菌，命名为HH-0708.经由16SrDNA序列测定、菌落形态观察、生理生化试验，HH-0708被鉴定为无乳链球菌。HH-0708体外药敏结果显示：其对青霉素、头孢呋辛、多西环素等11种抗生素高度敏感，而对四环素、庆大霉素等9种抗生素表现出较强的耐药性，对链霉素、红霉素等其他5种抗生素，表现为中度敏感。关键词：罗非鱼;无乳链球菌;16SrDNA;药敏试验;生化实验：S943自1976年起，于水生生物海豚中首次分离到链球菌后，链球菌类的细菌性疾病便在罗非鱼、宝石鲈等水生生物养殖中多次爆发，造成严重的经济损失[1-3]。因罗非鱼具有良好的繁殖能力，肉质鲜美，无肌间刺，具有较高的经济价值，所以成为我国重要的水产养殖品种[4-5]。但是由于养殖密度的增高，抗生素滥用等问题，链球菌等细菌性疾病频发，造成了严重的经济损失。为更好进行疾病防控，需从病鱼中分离病原菌，了解其生理生化特性后，再深入进行病原菌耐药性[6-8]、毒力因子[9]、疫苗方面[10]的研究，方便对同类疾病进行快速、精确防控。海南省三亚市网箱养殖罗非鱼爆发细菌性疾病，从中分离得到一株病原菌，通过序列比对和生理生化分子鉴定，确定为罗非鱼源的无乳链球菌，在实验室内利用纸片扩散法，对药物敏感性进行检测，为避免罗非鱼源细菌性病害的大规模爆发，以及养殖的进一步发展提供生物学基础。1材料与方法1.1实验材料2020年7月份，海南省三亚市崖州区牛落水库网箱中罗非鱼出现大量死亡的情况，发病罗非鱼的体长为12～15cm，体质量为100～200g。观察并记录鱼体的运动状况及病理特征，从罗非鱼养殖网箱内捞出10尾濒死的罗非鱼，塑料袋充氧后运回实验室，进行后续病原分离、病原鉴定实验。实验所用材料见表1。1.2病原菌的分离、纯化在超净工作台内，用75%乙醇擦拭濒死的罗非鱼体表，之后进行罗非鱼各组织、器官的病原分离，具体包括：肝脏、脑、脾脏、血液、肾脏等，组织样在脑心津液固体培养基上划线，培养环境：30℃恒温培养箱;培养时间：24h。对平板上的优势菌落进行三区划线，纯化菌株。对纯化后长出的单一菌落进行保种，具体操作：制备好无菌脑心津液培养基，将单菌落转接于培养基内，培养环境：30℃振荡培养箱;转速设定：180r/min;培养时间：16～20h，后将培养好的菌液与50%的无菌甘油混合，于-80℃超低温冰箱中保存备用。1.3病原菌鉴定1.3.1病原菌形态观察将病原菌划线、纯化的脑心津液培养皿倒置，培养环境：30℃恒温培养箱;培养时间：20h，观察并记录菌落形态。1.3.2分子鉴定1.3.2.1PCR扩增与测序提取菌液DNA后，利用细菌16S的通用引物进行扩增，序列预期长度为1500bp。取6μL的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，部分扩增产物寄送基因技术有限公司，获取菌株16S核酸序列。16S通用引物序列为：27F：（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）1492R：（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）1.3.2.2系统发育进化树的构建登入NCBI官网，将测序结果上传至Microbes，进行Blastn同源性分析，记录查询结果，并下载链球菌属核酸序列。利用Mega7.0软件，生成HH-0708的系统发育进化树，设定构建法则：邻接法;Bootstrap值：1000;距离检测方法：clustalV。1.3.3生理生化鉴定利用生化鉴定管的反应情况，根据不同功能产生的生理生化反应對菌株种属进行鉴定，观察其与各种酶类发生氧化发酵的能力，水解七叶苷和明胶的能力，利用各种糖类产酸的能力，以及不同盐度下的生长能力的变化。对照菌株：无乳链球菌（NCTC8181）。1.4药敏试验本次药敏试验原理为纸片扩散法。具体操作：将上述培养好的菌液，吸取100μL，均匀涂布于LB平板，后取药敏纸片贴于该涂布平板表面。药敏平板培养温度：30℃;倒置培养;培养时间：24h。利用游标卡尺测定抑菌圈直径，并判断菌株对各抗生素的敏感性。2结果2.1病原菌的形态学观察对脑、肝脏、脾脏等取样部位进行病原菌的分离，长出的菌落形态基本一致，认定为优势病原菌落。挑取长出的单菌落，于无菌的脑心津液培养基进行划线纯化，长出的菌落形态一致，均表面光滑、边缘整齐，呈乳白色。2.2病原菌的分类鉴定2.2....