酵母表达系统表达外源基因的研究进展第20卷第4期1999年12月7弓一首都师范大学学报(自然科学版)Journal0fCapitalNormalUniversity(NaturalScienceBdition)Vol-20.No.4Dec1999酵母表达系统表达外源基因的研究进展张飞雄立lJ_旦‘首都师范大学生物系)(空军总医院分子生物学研究中心)摘要/7阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,井对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较.我们认为:甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景关键词:酵母表达系统,外源蛋白,糖基化程度,甲醇营养型酵母:Q936外塬釉酵母菌是一类单细胞真核生物人类对酵母菌的应用,尤其是酿酒酵母,具有几千年的悠久历史.积累了大量的生物学和遗传学方面的资料.鉴于酵母菌生长旺盛和其独有的一些特性.它已被发展成为表达外源基因的重组表达系统酵母作为单细胞生物一方面在操作和生产上具有细菌表达系统的特点;另一方面又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程.如,二硫键的正确形成;前体蛋白的水解加工;糖基化作用等.利用酵母表达系统表达外源蛋白的宿主包括:酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae);乳酸克鲁维亚酵母(Kluyveromyceslactl);粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe);烷烃利用型耶鲁酵母(YarrowiⅡli加lytica);西方许旺氏酵母(Schzvanuiomyceseccidentalis);多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和巴氏毕赤酵母(Pichiastoris)本文旨在对酵母表达系统的研究现状及应用前景做一综述.1几种常用的酵母表达宿主及载体1.1酿酒酵母酿酒酵母(s.cerevisiae)很早就被应用于食品和饮料工业,也是人们最先建立的酵母表达系统.自1981年Hitzeman等首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达成功后.相继又有多种外源基因在该表达系统中表达成功_2】.目前已发展和建立了几种该表达系统的表达---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---载体,但以整合体型(YIp—type)载体和附加体~(Yep-type)载体最为重要.整合型载体不舍自主复制序列(ARS),而是被整合到酵母宿主菌的染色体上,这类载体的优点是稳定性好,但它的缺点是拷贝数低附加体型载体,由于含有来自酵母天然质粒2复制起点序列,能够独立于酵母染色体外自主复制,拷贝数通常可达30拷贝以上,但在非选择条件下多不稳定.发酵收祷13期:1998.10-2774首都师范大学学报(自然科学叛)1999正生产过程中质粒丢失仍是问题j.1.2克鲁维亚酵母乳酸克鲁维亚酵母(K.~ctis)被作为工业化生产人用蛋白的安全微生物.利用乳酸克鲁维亚酵母进行大规模工业化生产时有其独特的优点:(1)可以高密度发酵;(2)不需要甲醇防爆装置;(3)工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力.乳酸克鲁维亚酵母可以利用乳糖作为唯一的能源和碳源由乳酸克鲁维亚酵母LAC4基因编码的半乳糖苷酶可使乳糖分解代谢.因此,在含有乳糖的培养基上生长时乳糖利用途径的酶类能够被强烈诱导J.现已分离得到了LAC4启动子,外源基因就可以在它的调控下表达.乳酸克鲁维亚酵母的表达载体也是通过附加体型载体和整合体型载体来表达外源基因.附加体型载体有三种:(1)胞质线性双股DNA杀伤质粒;(2)含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列(称KARS);(3)稳定高拷贝数2样pKD1和pKWl质粒第一种质粒对外源蛋白的表达有限,因为胞质线性双股DNA杀伤质粒pGKL1和pGKL2均是线性的,在其5端含有共价结合的蛋白,因此在体外和大肠杆菌中操作复杂.限制了其作为表达外源蛋白载体的作用.KARS质粒的主要问题是有丝分裂的不稳定性.pKD1是一种环形质粒,可在乳酸克鲁维亚酵母中复制.并有稳定的高拷贝数(70—100/每个细胞)其功能性结构与酿酒酵母的2质粒非常相似,甚至有一些相同的序列】.Fke.等用pKD1载体成功地表达了人血清白蛋白和白细胞介素lB但是人们也发现pKD1类载体是菌种依赖性的,并且受启动子和培养条件的影响很大.对于整合体型载体而言,表达盒被整合到克鲁维亚酵母基因组中的LACA位点或核糖体DNA重复序列中.这种整合方式不仅可以提高外源基因的稳定性.还可以提高被整合基因的拷贝数.1.3甲醇营养型酵母甲醇营养型酵~:(Methylotrophicyeast)包括:巴氏毕赤酵母(P.pastoris)和多形...