肺癌细胞应用草欢蓉苯丙素昔(PGBR)对其增殖抑制与可能机制分析具英花(中国医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁沈阳110013)【摘要】FI的：研究草欢蓉苯丙素昔(PGBR)对于肺癌细胞的增殖抑制作用以及可能作用机制。方法：体外培养肺癌细胞，并加入PFBR绘制细胞抑制曲线，采用四甲基偶氮囑卩坐蓝(MTT)比色法观察PFBR对于肺癌细胞的增殖抑制作用，并采用流式细胞术检测PGBR作用于肺癌A549后细胞的周期分布情况，采用TUNEL染色法测定细胞凋亡情况，并采用免疫细胞化学法测定蛋白表达水平。结果：PFBR处理后肺癌A549细胞的增殖抑制率及凋亡率均显著提高，且随着作用时间及PFBR剂量的增加而显著提高(P《0.05)；观察组Bax、Fas及P53的蛋白表达水平显著高于对照组，Bcl・2的蛋白表达水平显著低于对照组(P《0.05)；PFBR处理观察组细胞周期停滞于G0/G1期，细胞周期分布率与对照组比较差异显著(P《0.05),且Al较对照组显著提高(P《0.05)o结论：PGBR能够抑制肺癌细胞的増殖，其可能作用机制为阻滞细胞周期并且诱导细胞的凋亡。【关键词】草忒蓉；苯丙素背；肺癌；细胞增殖；凋亡；周期【1R734.2【文献标识码］A【11004-6194(2015)01-0035-02草欢蓉是一种天然药用植物，属列当科，主要生长于我国长白山地区。中医学认为，草欢蓉具有滋补强身、润肠止血、补肾壮阳以及延年益寿等功效，现代药理学研究表明，草欢蓉具有增强机体免疫、抗肝纤维化、抗脂质过氧化、抗氧自由基、抗炎以及抗肿瘤等多种作用⑴。苯丙素昔(PGBR)是草欢蓉的主要成分Z一，具有消炎、抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤等广泛生物活性作用。既往研究表明，草欢蓉中没食子儿茶素・3■没食子酸酯(EGCG)、环烯醛祜廿(IGBR)等多种活性成分均具有促进肺癌细胞凋亡的作用，这为草欢蓉用于治疗肺癌提供了理论基础。本研究分析了草就蓉抗癌活性成分PGBR对于肺癌细胞的增殖抑制作用，并探讨了其可能作用机制，旨在为草忒蓉的药物研发以及临床应用提供参考，现报道如下：1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株肺癌A549细胞株购自南京凯基生物技术公司。1.1.2药物与试剂四甲基偶氮噬哩蓝(MTT)购自美国Sigma公司，小牛血清由北京华美生物工程有限公司提供，RPMI-1640培养基由美国GIBCO公司提供，胰蛋白酶由美国DIGCO公司提供，鼠抗Bcl・2、Bax、P53以及Fas单克隆抗体以及细胞凋亡原位检测试剂盒均由北京中金桥生物技术有限公司提供。1.1.3仪器设备Olympus倒置显微镜由日本Olympus公司提供，紫外分光光度仪(HITACHIU-2010型)由日本日立公司提供，酶标仪(RT・21OO型)由深圳雷杜生命科学股份有限公司提供，病理图像分析仪(YPS2000)以及流式细胞仪(Calibur型)由上海华岩仪器设备有限公司提供，凝胶柱(MCI-gelCHP20P)由日本MitsbishiChemical公司提供。1.2方法1.2.1PGBR的提取草就蓉全草10kg洗净并晾干后切碎，以90%的乙醇通液进行提取，所得提取液进行减压浓缩处理，最终获得提取物1.88kgo采用重蒸憾水溶解提取物，并置于等体力乙酸乙酯以及正丁醇中进行萃取和分离，获得水层后，常规进行减压蒸憾处理，获得1.42kg正丁醇提取物。准确量取200g提取物，置于凝胶柱上,分别采用30%、50%、70%以及100%的甲醇进行梯度洗脱处理，然后收集50%甲醇洗脱所得成分，采用硅胶柱色谱进行层析，采用10：2:0.1CHCI3-MeOH-H2O进行洗脱处理，最终获得PGBR(4.29%)。1.2.2肺癌细胞增殖抑制试验肺癌A549细胞置于PH为7.2的RPMI1640培养液（含有10%灭活小牛血清+100U/ml链霉素+100U/ml青霉素）中，置于相对湿度为90%、温度37°C及含有5%CO2的恒温孵育箱中进行培养。选取对数生长期细胞，在96孔板上按照l105个/孔进行接种，200mu;l/孔。观察到细胞铁壁生长以后，将细胞分为5组，包括实验组3组（加药）、不加药阴性对照组1组以及不接种细胞空白对照组1组。实验组3组分别加入PGBR使其最终浓度为50mg/L>100mg/L和20mg/L,对照组不加药，加入等剂量生理盐水。三组分别培养12h、24h和48h,在各吋间点各浓度均分别设置复孔6个。在培养结束前4h,想各孔中加入20mu;l浓度为5g/L的MTT溶液，继续孵育4h,结束孵育后，留取下层，加入DMSO150mu;l,匀速轻微振荡lOmin,观察到结晶物质均充分溶解后，置于酶...