中国人群慢性牙周炎患者龈下菌斑中的细菌群落结构分析李沫沈陆漆正楠唐子圣秦胜营摘要为确定6名中国慢性牙周炎患者龈下菌斑的细菌群落结构，将扩增的菌斑中的细菌16SrDNA序列克隆到大肠杆菌.测序后对323条可鉴定的克隆序列进行分析，发现龈下细菌群落主要由6种细菌门类组成，而细菌属类的分布差异较大.这为提高慢性牙周炎发病机制的认识、提供更多的有效预防和治疗措施提供参考.关键词中国人群；牙周疾病；慢性牙周炎；牙菌斑；16SrDNAQ939.93文献标识码A1000-2537（2017）06-0040-04AbstractThepurposeofthisstudywastodeterminethebacterialcompositionofhumansubgingivalplaquein6Chinesechronicperiodontitispatientsandproviderelatedbacterialdistributioninformation.Amplifiedbacterial16SrDNAsequencesareclonedintoEscherichiacoli.Aftersequencing，323identifiedclonedsequencesareanalyzed，thesubgingivalmicrobialcommunitymainlyconsistedof6bacterialphyla.Howevertheproportionsofbacterialgenerainthesubgingivalplaquesamplesaredifferent.Thisstudyprovidesthebasisforraisingawarenessofthepathogenesisofchronicperiodontitisandprovidingmoreeffectivepreventionandtreatment.KeywordsChinese；periodontaldisease；chronicperiodontitis；dentalplaque；16SRibosomalDNA牙周炎是牙周组织的一种慢性感染性疾病，是口腔两大类主要疾病之一，在国内外均有较高的患病率.目前大量研究显示宿主对微生物不恰当的免疫反应是造成牙周组织破坏的主要原因.然而，由細菌感染引起的慢性牙周炎的详细病理机制仍然不完全清楚[1].研究显示一些革兰氏阴性细菌类群在牙周疾病中发挥着重要的作用[2]，微生物群落结构可能与牙周疾病的发病机制有关[3].因此，准---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---确了解病原体微生物和宿主之间的相互作用关系首先需要了解牙周微生物群落信息[4].尽管人类频繁接触不同种类细菌以及个体间潜在的传播，但每个人往往保持自己的牙周菌群结构，这表明牙周菌群个体差异可能受到遗传或环境因素的影响[5].有研究证实有些牙周疾病的发生在不同种族成员之间存在显著差异[6].然而，也许是由于这些研究中使用的样品数量有限，菌群的组成在个体、种族、群体的差异仍然不是完全清楚，特别是很少有研究提供有关中国慢性牙周炎患者的口腔菌群结构信息，而这对研究者认识牙周病发病机制很重要[3].1材料和方法1.1慢性牙周炎患者的收集及选择标准选择6例慢性牙周炎患者，均就诊于上海交通大学医学院附属上海第九人民医院口腔内科，都是中国人血统，其中3名29～67岁女性患者，3名32～60岁男性患者.所有患者都签订书面知情同意书，并通过了上海第九人民医院的伦理委员会审核.1.2样品的采集与DNA的提取分别在每位患者4个象限口选择4颗最深的牙周炎牙齿为样品，用气吹枪保持牙齿面干燥.清除掉牙齿表面的菌斑后，使用龈下刮治器获得龈下菌斑，然后把6个患者的样品分别放入装有1mLPBS的1.5mL离心EP管.10000r/min离心，去除上清液，-20℃保存.使用Zoetendal[7]建立的“洗涤，冻融，珠打浆机，苯酚-氯仿”方法提取DNA.取1μLDNA溶液用0.8%琼脂糖凝胶电泳以检测DNA的纯度和完整性，剩余DNA溶液在-20℃冷冻保存.1.3PCR扩增16SrDNA片段，并克隆使用一对通用引物[8]在标准条件下进行16SrDNA扩增.PCR反应在ABI9700热循环仪中进行.使用1U的LATaq聚合酶（Takara）（50μL终体积）在热启动说明书指导下，将样品在95℃下预热8min，随后在以下条件下扩增：变性95℃45s，退火60℃45s，延伸1.5min.共进行30个循环，随后在72℃延伸10min.PCR扩增的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检查，DNA用溴化乙锭染色并在短波紫外线灯下观察.使用TOPOTA克隆试剂盒（英杰公司）参照说明完成PCR扩增后DNA序列的克隆.将转化的细胞铺板到含有卡那霉素的Luria-琼脂培养基平板上并在37℃保温过夜.单菌落转到含40μL10mmol/LTris的1.5mL离心管中.取1μL作为模板，鉴定在PCR中是否插入正确的M13正向引物和反向引物.随后通过1%琼脂糖凝胶的电泳检测插入片段的大小....