不同花色白芨四种DNA条形码的序列分析曾丽娜刘显义石建龙摘要：采用CTAB法提取2种花色白芨基因组DNA，选用trnH-psbA、rbcL、ITS、LSUD1-D34种植物DNA条形码通用引物进行PCR扩增，分析黄花、紫花白芨（Bletillastriata）4种DNA条形码的序列，扩增产物纯化后连接T载体并测序，用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对分析。再根据SNP位点设计引物，利用位点特异性PCR扩增进行鉴定。结果表明，4对植物DNA条形码通用引物均能进行扩增，其中trnH-psbA序列没有发现SNP位点、rbcL序列出现2个SNP位点、ITS序列出现62个SNP位点、LSUD1-D3序列出现3个SNP位点。根据LSUD1-D3序列上的2个SNP位点设计的引物DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）和JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′）能准确鉴定出黄花白芨，成功获得鉴定黄花白芨的引物序列。关键词：白芨（Bletillastriata）；DNA条形码；PCR；SNP：R282：A：0439-8114（2018）17-0106-05DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2018.17.027开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Abstract：GenomicDNAwasextractedfromthetwokindsofcolorofBletillastriatabyusingtheCTABmethod.ToanalysisthesequenceofdifferentflowercolorofBletillastriatabasedonthefourkindsofDNAbarcodeforfurtheridentification.FourDNAbarcodingmarkers（trnH-psbA，rbcL，ITSandLSUD1-D3）wereselectedforPCR.PCRproductwasligatedintoTvectorforsequencing.ThesequencingresultswereanalyzedbyusingDNAMANsoftware.AccordingtotheSNPlociofdifferentcolorofBletillastriata，theprimersweredesignedforidentifyingdifferentcolorofBletillastriata.Resultshowedthat：twokindsofflowercolorofBletillastriatagenomicDNAcanbeamplifiedbasedon4pairsprimersofplantDNAbarcodemarkersandSNPlociwerefound.NoneSNPlocuswasfoundintrnH-psbAsequence.TwoSNPlociwerefoundinrbcLsequence.Sixty-twoSNPlociwerefoundinITSsequence.ThreeSNPlociwerefoundinLSUD1-D3sequence.PrimerDUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）andJDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′）canbeusedforidentifyingtheyellowflowercolorofBletillastriataaccordingtotheSNPlociinLSUD1-D3sequence.TheprimerswerefoundforidentifyingtheyellowflowercolorofBletillastriata.Keywords：Bletillastriata；DNAbarcode；PCR；SNP白芨（Bletillastriata）為兰科（Corchidaceae）白芨属（Bletilla）多年生草本植物，是中国重要的中药材。商品白芨为白芨属白芨假鳞茎制成的干燥块茎，性平味苦，具有敛气、渗痰、止血、消肿等功效，主要用于治疗咳血、吐血、外伤出血、溃疡病出血等。白芨属植物全世界共有6种，其中中国有4种，即华白芨（Bletillasinensis）、小白芨（Bletillaformosana）、白芨（Bletillastriata）和黄花白芨（Bletillaochracea）[1]。主要分布在贵州、广西、安徽、四川、云南、陕西和湖北等地，其中以贵州、广西、湖北、安徽野生种质资源分布最为丰富。由于白芨种子发育不完全，常规条件下很难发芽。近年来，随着药理研究的深入，市场需求强劲增长，人们疯狂采挖野生资源，导致野生白芨资源急剧减少。为满足日益增长的市场需求，白芨组培快繁技术与直播技术相继研发成功[2-5]，全国各地掀起白芨人工种植热潮。但是，用于繁育种苗的白芨果荚均没有经过品种选育，而是采集于野生白芨资源。于是，在白芨种植基地中普遍出现黄花、白花、紫花白芨混杂的情况，大大影响药材安全。《中国药典》规定药用的主要为紫花三叉白芨，其他黄花、白花白芨等都是习用品和伪品。为此，迫切需要研发能在幼苗或种茎时对黄花、白花、紫花白芨进行快速鉴定的方法。有关白芨属植物的鉴定，已有从形态学、化学成分以及ISSR、RAPD等DNA分子标记方面的报道[6-8]，这些研究都为白芨属药用植物的鉴定提供了依据。DNA条形码的出现，为白芨属药用植物的鉴定带来了新的思路。DNA条形码技术（DNAbarcode）是利用相对较短的标准DNA片段对物种进行快速、准确鉴定的一门技术。由加拿大分类学家PaulHebert在2003年首次提出，该技术可以从...