应用慢病毒转染hTERT基因在人卵巢腺癌SW626细胞中的表达研究赵国栋1回丽妹2赵建军3赵国栋1回丽妹2赵建军3通讯作者1.河北工程大学附属医院普外一科河北邯郸056002;2.河北工程大学附属医院产科河北邯郸056002;3.河北工程大学附属医院泌鉍外科河北邯郸056002【摘要】目的观察携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体转染SW626细胞(人卵巢腺癌细胞株)后hTERT基因在靶细胞屮的表达.方法将携带R的基因hTERT的重组慢病毒表达载体及包装系统共转染293T细胞(人胚肾上皮细胞株),通过超速离心沉淀法浓缩病毒上清P转染SW626细胞.转染前将靶细胞分为转染组、空转组及对照组，完成转染后于显微镜卜观察靶细胞屮绿色荧光蛋白显色,并应用PCR检测SW626细胞屮hTERTmRNA的表达.结果293T细胞经重组慢病毒与包装质粒共转染后能产生重组病毒并且能够成果的将目的基因hTERT高效地转导入靶细胞SW626细胞屮并稳定表达，荧光显微镜下可直接观察到GFP;转染后的SW626细胞经检测，其内hTERT棊因mRNA表达明显增强.结论重组慢病毒表达载体LV4-pGLV-EF1a—EGFPhTERT能够高效稳定地将外源hTERT基因导入SW626细胞并使其长久表达，为卵巢肿瘤生物治疗研宄奠定了科研基础.【关键词】慢病毒；转染；hTERT;端粒酶【屮图分类号】R346【文献标识码】B【文章编号】1008—6315(2015)10-0423-01端粒酶是一种核糖核酸蛋內复合体，能够延长端粒末端并保持端粒长度，主要有3个亚单位组成，即端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白及其催化亚单位端粒酶逆转求酶棊因(HumanTelomeraseReverseTranscriptase,hTERT).正常真核细胞的端粒可被称作“生命之钟”[1].伴随端粒酶活性的增加,hTERTmRNA表达水平也相对应成一定比例增加,hTERT是调控人类端粒酶活性的主要亚单位，只要hTERT表达其他亚申位就会与其共同构成高活性的端粒酶全酶[2].慢病毐载体具奋感染宿主广、基因整合率---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---高且稳定、性质较稳定等诸多优点[3],通过构建携带人端粒酶逆转录酶基因的慢病毒表达载体，并观察转染后靶细胞内hTERT基因表达，从而为卵巢肿瘤生物治疗提供一种有效的科研手段.1材料与方法1.1材料携带目的基因hTERT的慢病毒表达载体(pGLV—EF1a—EGFPhTERT);不携带任何外源基因的表达载体pGLV—EF1a_EGFP;感受态DH5α、人胚肾上皮细胞株293T细胞、人卵巢癌细胞株SW626.1.2主要仪器与试剂超浄台,CO2细胞培养箱,DEME高糖细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、24孔及96孔培养板，光学显微镜,5180R高速低温离心机，垂直电泳仪无内毒素质粒小提试剂盒,Lipofectamine2000,PCR试剂.1.3引物设计所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成.根据hTERTmRNA序列用PrimerPremier5.0软件设计hTERT引物.GAPDH作为内参.hTERT:上游引物:5′—3′GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG下游引物：5′—3′CGACGTAGTCCATGTTCACAA拟扩增长度：254bpGAPDH:上游弓|物:5′—3′GAAGGTGAAGGTCGGAGT下游弓I物：5′-3′GAAGATGGTGATGGGATTTC拟扩增长度:226bp1.4方法1.4.1慢病毒包装将处于对数生长期的293T细胞接种于六孔板中,每孔约3×106个细胞，使其生长到转染当天达到70%左右的融合度，加入含10%FBS的高糖DMEM培养基，放于37°C、5%CO2培养箱中过夜培养.根据质粒质量换算出所需的体积，取6个1.5mL火菌的EP管，分别加入1.5μg包装、混合质粒和0.5μg表达质粒及无血清的高糖DMEM培养基，使总体积为250μL.轻轻混匀后于室温静置5min;取6个1.5mL火菌EP管，分别取10μL脂质体2000溶于240μL无血清DMEM培养基中.轻轻混匀后于室温静置5min;将DNA溶液和脂质体溶液轻轻混匀.室温静置2Omin;PBS轻轻冲洗六孔板中的293T细胞2—3次,各孔分别加入DNA溶液与脂质体的混合液500&mu人置于37°C5%C02培养箱中；6—8h后观察细胞，形态基本不改---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---变说明细胞耐受，移去DNA溶液与脂质体的混合液，加2mL含10%FBS含双抗的新鲜高糖DMEM培养基，可于镜下观察绿色荧光;72h后收取病毒上清,超速离心沉淀(4°C,30...