POKemon、pl4ARF基因链在大肠癌细胞系的表达相关性分析及临床意义李亚玲1郭江红1白讳1高宁1杨晓棠1*山西省肿瘤医院030013【摘要】目的研宄POKemon、pl4ARF基因在结直肠癌细胞系屮的表达情况。方法采用RT-PCR、细胞免疫化学技术检测POKemon、pl4ARF在5种人结直肠癌细胞屮的表达。结果POKemon在SW480、SW480/M5、LOVO、SW620屮阳性表达，在HCT116阴性表达；P14ARF在HCT116阳性表达，其余细胞均阴性表达。结论结直肠癌细胞系屮存在POKemon的表达，且与pl4ARF作用负相关。【关键词】POKemon基因；pl4ARF基因；大肠癌【屮图分类号】R473【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-08-042-02POKemon是近年发现的肿瘤发生相关基因，是抑癌基因pl9ARF启动子的特异性转录抑制因子，间接调控着P53通路，最终促进细胞增殖及瘤性转化。本研宄以大肠癌细胞为研宄对象，从mRNA与蛋白质水平分别检测POKemon、P14ARF基因表达情况，检测其表达并分析两基因相互作用。1材料与方法1.1细胞人肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116、LOVO、SW480/M5,细胞株均购于ATCC。其屮LOVO和SW620是结直肠癌淋巴结转移癌建系，具有高转移性，SW480和HCT116是结直肠癌原发癌建系,SW480/M5是结直肠癌肝转移癌建系。1.2试剂RPMI-1640培养基（GIBCOInc），小牛血淸（GIBCOInc）,胎牛血淸（杭州四季青），DEPC（北京赛百盛公司），Trizol（lnvitrogenInchPOKemon、P14ARF引物用Primer5软件自行设计POKemon:5’-GAAGCCCTACGAGTGCAACATC-3’,5’-GTGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG-3,962bp；pl4ARF：5’-AGTGGCGCTGCTCACCTC-3’,5’-TCCCGAGGTTTCTCAGAG-3’360bp；β-actin：5’----本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---GCTCGTCGTCGACAACGGCT-3’5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’,670bp,由赛百盛公司合成。POKemon一抗由RobinM（DepartmentofPathologySloan-KetteringUSA）博士惠赠，pl4ARF（NeoMakers公司），SABC免疫组化试剂盒（博士德公司）。1.3.方法1.3.1细胞培养人结直肠癌细胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，置37°C、5%C02培养箱内培养，取生长状态良好的细胞用于实验。1.3.2RT-PCR待细胞长至状态良好，铺满瓶壁后，参照说明书，用Trizol试剂常规提取细胞总RNA；用紫外分光光度计检测RNA的产量，测量260nm和280nm处的吸光度，lOD=40ug/mlo将处理好的RNA样品，稍离心，80V恒压电流25mA电泳20分钟，在紫外凝胶成像仪上观察结果。cDNA链合成，PCR扩增目的片断。PCR产物检测及鉴定，琼脂糖凝胶电泳；收集PCR产物，4°C保存，由博亚公司测序分析。1.3.3免疫细胞化学方法检测蛋白表达制备单细胞悬液接种于六孔板中的盖玻片上，5%CO2培养箱内培养36小吋，取出，PBS漂洗；95%乙醇固定,PBS漂洗；滴加5%BSA封闭液，室温15min;去掉多余液体，不洗，滴加一抗、二抗、SABC复合物、DAB与H2O2,显微镜观察显色，蒸馏水洗中止；苏木素衬染，分化反蓝，脱水封片。结果判断：POKemon和pl4ARF均为胞膜或胞浆显现棕黄色者为阳性，以PBS代替一抗作为阴性对照。2结果2.1细胞培养：生长状态良好，贴壁状态伸展。2.2RT—PCR2.2.1经紫外分光光度计检测，提取的总RNA含量，均大于lμg/μl,A260/A280的比值符合实验要求，变性凝胶电泳检测均为3条带，28S和18S两条带清晰可见，无拖尾，证明RNA质量良好，未发生降解。2.2.2POKemon和pl4ARF的PCR产物电泳5种结直肠癌细胞中,POKemon基因在SW480、SW480/M5、LoVo、SW620阳性表达,在HCT116阴性表达。2.2.3POKemon和pl4ARF的PCR产物测序，测序结果碱基排列与genebank提供序列相同。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---2.3POKemon和pl4ARF免疫细胞化学检测POKemon在细胞株SW480、SW480/M5、LoVo、SW620的细胞膜与浆均奋阳性信号表达，在HCT116细胞中阴性表达。P14ARF在HCT116中阳性表达，苏余细胞中阴性表达。3.讨论POKemon作为POK家族的成员之一，最初作为特异连接HIV-1启动子区域被证实［l】、MaedaT［2］等用癌基因分别或联合转染WTMEFs，结...