斑螯酸钠对体外培养的EJ细胞的实验研究［摘要］目的观察斑螫酸钠对体外培养的人膀胱癌系EJ细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法EJ细胞贴壁后分为对照组、1组、2组、3组、4组、5组，分别给予0、0.5、1、5、10、15g/L浓度斑螫酸钠处理,24h后采用流式细胞仪检测细胞周期情况，CCK-8法检测斑螫酸钠对EJ细胞增值抑制的影响，荧光倒置显微镜下观察细胞的凋亡情况，琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况。结果以0.5、1、5、10、15mg/L5个浓度的斑螯酸钠作用于EJ细胞24h,EJ细胞的增殖出现不同程度的抑制，且与药物浓度成正相关。1、2、3、4、5组抑制率与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)o对照组S期细胞比例为8.94%,G2/M期为4.16%,G0/G1期为86.91%，与1、2、3、4、5组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)o使用斑螫酸钠作用EJ细胞24h后，电泳出现凋亡特有的阶梯状条带，随着药物浓度的增加，凋亡带增多，而对照组则没有出现凋亡带。荧光显微镜下，对照组未出现凋仁小体，加入斑螫酸钠的药物组有凋亡小体出现，0.5、5g/L斑螫酸钠药物组凋亡细胞数较少，15g/L斑螫酸钠药物组凋亡细胞数较多。结论斑螫酸钠对体外培养EJ细胞增殖有显著的抑制作用，诱导EJ细胞凋亡。［关键词］斑螫酸钠；EJ细胞；CCK-8；细胞凋亡［中图分类号］R730.53［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2013)08(c)-0026-03斑螫酸钠（sodiumcantharidinate,SCA）为斑螫素衍生物，常被用于恶性肿瘤的治疗［1-2］,抗癌作用较斑螫素强，可阻止癌细胞DNA合成,提高机体免疫力［3-4］o临床上作为消化道恶性肿瘤的化疗药物，单独或联合使用，具有一定的疗效，还可以作为配合放化疗使用，在提高疗效的同时，改善胸部不适、食欲减退、恶心呕吐等放化疗的副作用［5］。斑螫酸钠还有较显著的抗癌抑制和免疫调节的双重作用，是一种广谱抗癌新药［6］。本实验以人膀胱癌EJ细胞为研究对象，通过不同方法探讨斑螫酸钠诱导膀胱癌凋亡的作用机制，为临床应用提供理论依据。1材料与方法1.1细胞株、仪器、试剂EJ细胞由解放军军事医学科学院遗传室惠赠，本院生命科学研究中心细胞培养平台传代、保种。CCK-8购自上海同仁化学试剂公司，RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产詁，特级胎牛血清购自北京元亨圣马牛物技术研究所，斑螯酸钠注射液由贵州神奇集团生产（批号：41113）,Hoechst（细胞凋亡）染色试剂盒购自中国江苏碧云天生物技术研究所，lOObpDNAMark.琼脂糖购自北京市六合通公司，碘化丙噪（PI）购自深圳晶美生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。主要仪器有：美国MD公司生产的SpectraMaxM2e检测系统，美国BD公司生产的FACSAria流式细胞仪，日木尼康公司生产的Ti-U荧光倒置显微镜。1.2EJ细胞培养将复苏的EJ细胞加入RPMI1640培养液中（pH7.4含10%胎牛血清,100U/mL庆大霉素）,37°C、5%C02孵育箱中培养。1.3CCK-8法检测斑螫酸钠对EJ细胞增殖的影响用适量消化液消化对数生长期的EJ细胞，然后用RPMI1640完全培养液配成2X105M细胞悬液加入96孔培养板，100pL/孔。第2天细胞贴壁生长后分为对照组、1组、2组、3组、4组、5组，分别加入0、0.5、1、5、10、15g/L斑螫酸钠100uL/孔，每个浓度设4个重复孔，37°C5%CO2温箱中孵育24h,取出后每孔加入20uLCCK-8,置于37°C培养4h°SpectraMaxM2/M2e仪器检测吸光度（A490值）。抑制率（%）=（1-药物组平均A490值/对照组平均A490值）X100%。1.4流式细胞仪检测细胞周期取不同浓度斑螫酸钠加入对数生长期的EJ细胞，分组及给药情况同"1.3"项下，24h后消化细胞，配成单细胞悬液，1500r/min离心7min,PBS洗2次，将细胞重悬于0.5mLPBS中,制成细胞悬液，加入PI0.5mL,4°C避光染色30min,流式细胞仪检测细胞周期情况。1.5琼脂糖凝胶电泳提取不同浓度斑螫酸钠处理的EJ细胞的DNA,分组及给药情况同“1.3”项下，进行琼脂糖电泳检测。称取40g琼脂糖，加入40mLTAE缓冲液中，微波加热使之充分溶解，待溶液冷却至60°C左右时，加入漠化乙锭（EB）,轻轻混匀，常规方法制1%凝胶，待彻底凝固后，取出放入电泳槽,依次加入样品和Marker,电压维持在80V,电泳30min后取出，在凝胶图像分析系统（HPIAS-1000,China）±观察并拍照，观察细胞凋...