人口腔粘膜上皮细胞的培养及生物学特性的研究〔摘要〕目的：探讨口腔粘膜上皮细胞的培养扩增方法及生物学特性。方法：取手术中切除的多余粘膜，分别用胰酶和Dispase分离后经胰酶消化，接种无血清培养基。将二者细胞数量、活力及融合时间加以比较，同时对细胞各代增殖特点、生长曲线、克隆形成率及血清对细胞分化的影响进行观察。结果：Dispase分离法的细胞总数，活细胞数均高于胰酶分离法。粘膜上皮细胞能够在无血清培养基稳定增殖传代，血清对上皮细胞有诱导分化作用。结论：Dispase分离的无血清培养技术可短期内获得大量具增殖能力的粘膜上皮细胞。关键词粘膜；细胞培养；上皮组织细胞中分类号：R329.2+8文献标识码：A文章编号：1001-3733(2000)04-0288-03AstudyofhumanoralmucosalepithelialcellcultureandcharacteristicsDingGuicong,MaoTianqiu,YangWeidong,etal.(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomatologicalCollege,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an,710032)〔Abstract〕Objective:Tostudytheoptimalprocedureforthecultureandamplificationoforalmucosalepithelialcells(OMEC)andtheirbiologicalcharacteristics.Methods:OMECwereprimarilyculturedwithtrypsinordispasedigestion.Thebiologicalcharacteristicsofthecellswereobservedthroughphasemicroscope,cellgrowthcurve,colonyformingefficiency.Results:Moreviablecellswereharvestedwithdispasedigestionandthecellsreachedconfluenceearlierthanwithtrypsindigestion.ThethirdpassageofOMECgrewwellinkeratinocyte-serumfreemedium(K-SFM),OMECwereinducedtodifferentiatewhenserumexistedinmedium.Conclusion:AlargenumberofOMECmayobtainedwithdispasedigestionandthecellsgrowwellinK-SFM.KeywordsMucousmembrane;Cellcultivation;Epithelialcell.口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及修复前的牙槽外科往往有大面积口腔粘膜缺损。自体粘膜移植修复是更为符合口腔生理要求的方法，但组织来源有限，因而传统上多采用自体皮肤移植代替缺失的粘膜。皮肤移植修复口腔缺损的同时，存在着明显的缺陷〔1〕。近年来发展起来的组织工程技术为此问题的解决开辟了新的途径。通过体外表皮细胞大量扩增而合成的人工皮肤目前已成功地应用于烧伤患者。因而如何利用组织工程方法合成粘膜来代替皮肤移植修复口腔粘膜，已引起学者的兴趣〔2〕。粘膜组织工程首先要解决种子细胞来源，保证获得足量且纯化的上皮细胞，而该问题的解决关键是建立可靠的上皮细胞培养扩增技术，国内该方面的研究尚少〔3,4〕。本研究目的是研究无血清培养条件下粘膜细胞的培养扩增方法及生物学特性，为粘膜的体外构建奠定基础。1材料和方法1.1材料人角朊细胞培养液（K-SFM，Gibco），胰酶（Sigma）,DMEM(Hyclone),DispaseII(Gibco)，胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所)。1.2方法1.2.1标本处理无菌条件下收集本院颌面外科手术中丢弃的多余粘膜，患者年龄2.5～62岁。置于体积分数为10%血清的DMEM中。PBS洗净血迹，2.5g/L洗必泰液浸泡5～8min，尽量去除粘膜下组织，并切成0.3cm×1cm大小的组织块。1.2.2标本分组每个标本分成相等两份，其中一份放入2.5g/LDispaseII溶液,4℃冰箱过夜；另一份则置2.5g/L胰酶4℃冰箱过夜，两组分离时间相同。然后用眼科镊将表皮撕下，将两组的上皮分别用2.5g/L胰酶37℃消化5～10min，DMEM（含血清）中止消化，吹打成单细胞液。血球板计算细胞数，台盼兰活细胞计数，以4×104个/cm2的细胞密度接种于含K-SFM的25ml培养瓶中。1.3观测指标1.3.1倒置显微镜下观察各代细胞形态。1.3.2细胞计数及台盼兰活力染色比较两种酶分离的特点。1.3.3细胞生长曲线并计算群体倍增时间取第2代正常粘膜上皮细胞，以104个/cm2的细胞密度接种24孔板，每一组为3孔，定期用胰酶消化计数，取3孔的平均数，绘制生长曲线，并计算群体倍增时间〔9〕。1.3.4细胞克隆形成率将第二代粘膜上皮细胞用胰酶消化，分别以102、103、104个/cm2的细胞密度接种培养瓶内，7d后倒置显微镜下观察含10个以上细胞克隆数并计算克隆形成率〔5〕。1.3.5血清对细...