内科学(心血管病)专业毕业论文[精品论文]中国人PRKAG2心脏综合征家系致病基因新突变PRKAG2G100S的功能研究关键词：PRKAG2心脏综合征致病基因基因突变发病机制摘要：研究背景：PRKAG2心脏综合征家系呈家族遗传性，属常染色体显性遗传；特点是家系成员可出现多种复杂的心脏病变，以心肌肥厚、传导系统异常及心室预激为主要表现。目前国外共报告了17个该病家系的致病基因分析，研究发现与PRKAG2基因突变有关，已经发现的9种突变包括8种错义突变：Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Tyr487His、Asn488Ile、Gln506Lys、Arg531Gly、Ser548Pro及一种移码突变InsLeu351，他们都集中在PRKAG2的Bateman区域。家系的致病基因分析报道中，PRKAG2基因最常见的突变位点是R302Q，已在9个家系和1名散发患者中检测到该突变。国内洪奎报道的中国人家系存在PRKAG2R302Q突变，未发现新的突变位点。我科张静博士报道的中国人大家系临床表现有心肌肥厚(56％)、预激综合征(46％)、窦房结功能不良或高度房室传导阻滞、猝死，有的还伴有房颤、房扑等房性心律失常。家系的临床表型符合国外家系报道的共性，对家系成员进行PRKAG2基因测序，在外显子3上发现了一个新的错义突变G100S，这个突变是国内外从来没有报道过的。目前，国外对PRKAG2基因的致病机制研究已经取得了令人瞩目的成绩，国内尚无相关研究报道。早期一些人认为PRKAG2突变引起能量缺乏，另一些人则认为膜电流异常或基因表达异常/心脏发育异常导致了心肌病。然而，随后的研究表明：PRKAG2心脏综合征是一种特殊类型的糖原累积性心肌病。在转基因小鼠模型和人类疾病中贮积的糖类分析证明了这种心肌病中的糖原积累。携带PRKAG2N488I错义突变的小鼠心脏糖原显著增多。随后，PRKAG2突变改变AMPK活性的研究解释了疾病显性遗传的模式、心脏糖原积累及传导系统中预激的表现型。为了验证PRKAG2G100S新突变在中国人PRKAG2心脏综合征家系中的致病作用，深入认识PRKAG2G100S错义突变引起的功能变化，推动PRKAG2基因的致病机制研究，我们通过在CCL13细胞中过表达突变基因，从细胞、分子水平研究了PRKAG2G100S突变的生物学功能。研究目的：研究基因PRKAG2G100S新错义突变的功能，探讨该突变在中国人家族性传导系统异常伴心室预激及心肌肥厚家系中的发病机制。研究方法：(1)人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建：通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC068598)，其N端缺失了44个氨基酸，根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM016203)，设计搭桥引物及序列扩增引物，通过PCR搭桥方法，合成完整全长序列的PRKAG2基因，并将其克隆到TA载体，得到的阳性克隆经测序鉴定。(2)携带野生型及突变型PRKAG2基因的重组慢病毒载体构建及鉴定：以PRKAG2基因为模板，利用PCR技术进行定点突变，设计4对引物，将突变位点设计在引物上，通过PCR扩增引物，扩增片段上含有所需要的突变位点，最后将扩增片段GS、RQ及正常PRKAG2基因(WT)克隆到慢病毒穿梭质粒pWPT内，构建表达PRKAG2G100S、PRKAG2R302Q及野生型PRKAG2基因的慢病毒载体，使用限制性内切酶进行酶切鉴定，并通过序列分析进行确证。(3)携带野生型及突变型PRKAG2基因的重组慢病毒载体的体外实验研究：包装慢病毒并感染CCL13细胞，建立过表达野生型及两种突变型PRKAG2基因的稳转细胞系(CCL13/WT、CCL13/GS、CCL13/RQ)，并以PRKAG2R302Q为阳性对照，PRKAG2正常基因为阴性对照，---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---未表达外源基因的CCL13细胞为空白对照，分别行FACS检测慢病毒感染情况、WesternBlot分析检测PRKAG2表达、免疫荧光检测野生型和突变型PRKAG2基因在细胞中的定位、MTT检测基因突变对细胞增殖的影响、PAS染色检测糖原含量、ELISA方法检测AMPK的活性，从细胞水平初步研究PRKAG2G100S新突变的功能结果。结果：(1)拼接出全长1707bp的PRKAG2基因，目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致。(2)在预期位点已经发生突变，904处碱基由A→C，905处碱基由G→A，使PRKAG2基因第302位密码子由精氨酸(R)突变为谷氨酰胺(Q)；2...