Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性影响和机制研究摘要：目的研究Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性的影响和机制。方法构建肺炎克雷伯菌hfg基因突变株与回复株，进行药敏试验，检测指标包括MIC、MBC，同时检测生长曲线、时间-杀菌曲线。结果头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶对肺炎克雷伯菌WJ101株的抑制作用均较强，抑菌浓度均＜32μg/ml。肺炎克雷伯菌WJ101株生物被膜定量检测的光密度平均值为0.039，与阴性对照孔的检测值（0.032）比较，差异不显著（P＞0.05）。hfq敲除株被膜定量检测的光密度平均值为0.053，明显高于肺炎克雷伯菌WJ101株与阴性对照孔的检测值，对比差异显著（P＜0.05）。结论Hfq对肺炎克雷菌耐药性具有一定的影响，其作用机制主要是调控肺炎克雷菌的生物被膜形成，是一种多机制共同作用的结果。关键词：Hfq；肺炎克雷伯菌；耐药性；影响；机制肺炎克雷伯菌属于革兰氏阴性菌，可分布于多种疾病中，是人类患病的主要致病菌[1]。近年来，肺炎克雷伯菌已被认定为是一种严重的多药物耐药菌，会对人类的身体健康与生命安全造成严重影响。鉴于肺炎克雷伯菌在临床上的耐药现象极为严峻，我们有必要探讨一种治疗肺炎克雷伯菌感染的有效疗效。基于---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---此，现就Hfq对肺炎克雷伯菌耐药性的影响和机制作进一步研究，总结报道如下。1材料及方法1.1实验材料1.1.1菌株与质粒肺炎克雷伯菌WJ101株源自本实验室。大肠杆菌DH5α源自北京天根生化科技有限公司，PKD46T质粒源自本实验室。pBR322、pHSG298质粒源自大连宝生物工程有限公司。1.1.2药品与试剂药品均为头孢菌素类药物，包括头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶，均源自中国食品药品检定研究院。化学试剂主要包括：细菌琼脂粉、L-阿拉伯糖、TRYPTONE、YEASTEXTRACT、氯化钠、REGULARAGAROSEG-10、二甲基亚砜、Mueller-HintonBroth培养基。1.2方法构建肺炎克雷伯菌hfg基因突变株：分两次把PKD46T质粒与hfq基因突变盒片段电转入肺炎克雷伯菌WJ101株，用卡纳抗性LB琼脂平板进行涂布筛选，最终用PCR与测序方法进行鉴定。结果显示：突变株有851bp、875bp条带，肺炎克雷伯菌WJ101株在目的处无条带。构建肺炎克雷伯菌hfg基因回复株：以肺炎克雷伯菌WJ101株基因组为模板，用KPhfqF/R引物进行pfu酶扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带切胶，用EcoRI、XbaI进行双酶切，再次回收酶切产物，pHSG298质粒用同种酶进行双酶切，并回收酶切产物。用T4连接酶连接两个回收片段，对回复的菌株用PCR与测序方法进行鉴定。进行肺炎克雷伯菌WJ101株药敏试验，检测指标包括最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）。同时，运用结晶紫定量法在630nm处检测肺炎克雷伯菌WJ101株及相应hfq敲除株形成的生物被膜，18h内进行定量，记录两种菌株的光密度平均值，---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---并与阴性对照孔的检测结果进行对比分析，以了解hfq对肺炎克雷伯菌生物被膜形成的影响与作用机制。1.3统计学方法运用SPSS19.0软件进行数据统计，计数资料以%表示，组间对比行x2检验，以P＜0.05提示差异显著。2结果2.1肺炎克雷伯菌WJ101株的药敏检测结果头孢噻肟、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、头孢他啶对肺炎克雷伯菌WJ101株的抑制作用均较强，抑菌浓度均＜32μg/ml。见表1。注：与阴性对照孔比较，#P＞0.05，*P＜0.05。3讨论肺炎克雷伯菌的分布十分广泛，致病谱极广，可在全球范围内传播，已形成全球重大的公共卫生问题，必须引起高度重视。肺炎克雷伯菌不仅是碳青霉烯类抗生素耐药菌感染的主要致病因素，对第三代头孢菌素类药物的耐药也非常严重[2]。甚至有研究学者认为，肺炎克雷伯菌感染已经无药可治。因此探讨其耐药机制，并未临床治疗开创新的途径尤为重要。Hfq蛋白属于细菌基于表达的一种转录后调控因子，可介导sRNA和mRNA的作用，其调控机制对多种细菌均可起到一定的影响，尤其是对于肺炎克雷伯菌而言，可在一定程度上影响其细胞过程与生理生化反应，其对宿主均的生长、代谢也会起到一定的影响[3]。本研究首先构建肺炎克雷伯...