人血清乙型肝炎表面抗体定量测定化学发光免疫分析方法的建立及应用董辉1,贺金云1,张云杰1,赵乔妹1,秦莉2,孙旭东2(1解放军总医院第一附属医院检验科,北京100037;2北京源德生物医学工程有限公司,北京100176)提要:目的建立人血清抗-HBs化学发光免疫分析方法并在临床检测中应用。方法使用自行研制的化学发光免疫定量分析方法检测530例临床血清标本中的抗-HBs,并与抗-HBs电化学发光全自动免疫分析方法进行对比,探讨其临床应用价值。结果本方法对国家抗-HBs参考品,20份阴性参考品均检定为阴性;精密性参考品变异系数小于15%;定量参考品检测结果均在规定范围内;灵敏度参考品能检测出10mIU/ml血清,完全达到国家参考品对定量方法的要求。与甲肝、丙肝、HIV、梅毒等患者血清无交叉反应;样本中抗凝剂量的柠檬酸钠、肝素、EDTANa2对测定结果没有影响。该方法正常参考值为10mIU/ml。ECLIA测定结果与本方法相比,临床总符合率为95.09%。结论该方法灵敏度高,特异性好,稳定性强,检测范围宽,有良好的准确性和重复性,完全可以替代进口化学发光试剂用于临床样本的检测。乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)[1,2]。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)能刺激机体产生抗-HBs[3]。血清学检测抗-HBs的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)及电化学发光免疫分析法ECLIA)等[4,5]。其中,CLIA和ECLIA因其操作的智能化程度高、灵敏度高、特异性强、检测范围宽,特别是无放射性危害及半衰期短等优势,目前已趋替代RIA和ELISA而成为免疫检测广大多采用ELISA定性分析;而抗-HBs定量分析多为CLIA和ECLIA检测,且主要在一些大中型医院应用,所用仪器、试剂均为进口,价格昂贵,无法满足定量检测抗-HBs的需要。本研究应用自行研制的化学发光定量分析方法测定人血清抗-HBs,并试验其在临床检测中的应用。1材料与方法1.1标本血清标本共计530份,年龄17~65岁。其中抗-HBs阴性标本386例,男性153例,女性233例,来自本院成年健康体检者。抗-HBs阳性标本144例,男性75例,女性69例。另取158例各种病毒感染血清、抗核抗体阳性血清、多发性骨髓瘤血清及孕妇血清,经ELISA方法测定均为抗-HBs阴性血清标本。上述标本均来自本院及北京佑安医院。1.2主要试剂与仪器乙型肝炎病毒表面抗原由北京源德生物医学工程有限公司表达及纯化。MPC-1型微孔板单光子计数仪为北京源德生物医学工程有限公司生产。Roche公司电化学发光全自动免疫分析仪Elecsys2010及配套抗-HBs测定试剂盒。ELISA试剂盒为北京万泰生物药业有限公司生产。其他所用化学试剂均为国产分析纯试剂。1.3方法1.3.1包被发光微孔板的制备包被乙肝表面抗原用pH7.4,0.02mol/L的PB配制为2.5μg/ml的包被液,每孔100μl包被微孔板,2~8℃过夜后,弃包被液。按每孔200μl加入含1%BSA的PBS封闭液,37℃封闭2h;洗涤干燥后放入密封袋内真空保存。1.3.2酶标记表面抗原的制备采用常规的过碘酸氧化法制备。0.1%的Proclin-300为防腐剂的新生牛血清做为酶稀释液,采用方阵滴定法确定酶结合物工作浓度。1.3.3校准品的制备用0.1%的Proclin-300为防腐剂的新生牛血清做为校准品稀释液。系列稀释抗-HBs阳性血清,并用国家参考品校定浓度。1.3.4发光液的制备按照专利(专利号91110621.9)配方由北京源德生物制备。1.3.5样本的获取取不同浓度的抗-HBs人血清5m,l分别加入不同浓度的肝素钠、15%的EDTA溶液、23.6%的(0·914mol/L)枸橼酸钠溶液、100mg/L胆红素溶液和160g/L血红蛋白溶液,得到含系列浓度的上述物质的血清样本;称量不同量的胆固醇及甘油三酯于上述血清中,得到系列样本。1.3.6抗-HBs测定过程取包被微孔板,每孔加入校准品或待测样本50μ,l加入酶结合物50μ,l37℃水浴,30min。洗涤后加入发光液,在单光子计数仪上测定相对发光强度。1.4统计学分析采用SPSS统计软件进行t检验及相关性分析。2结果2.1方法学评价2.1.1抗-HBs国家参考品测定抗-HBs国家参考品包括阴性参考品、定量参考品、灵敏度参考品、精密性参考品。结果表明,20份抗-HBs阴性参考品均检定为阴性;精密性参考品的相对发光强度变异系数CV=3.16%(要求≤15%);定量参考品标示浓度值与测定值做线...