猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究唐先春\吴斌二索绪峰2,壬大林2,陈焕春\尹争艳I(1.华中农业大学动物病原微生物实验室,武汉430070)(2.海口市美兰区罗牛山曾医站,海南571133)摘要:用PCR方法配合生化鉴定,从有肺炎症状猪的肺脏及进行:性萎缩性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(呛妣心/amultocida.Pm).然后做了药娥试验,并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒索基因的检测,用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic〃。“"〃/oc/'da,T^Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致;PCR分型表明有46株为D型Pm,18株为A型Pm,I株为B型Pm,I株无法定型:有8株用PCR检测为T+Pm:豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株VPm的进一步鉴定,也表明均为产毒索菌株。所鉴定的8株FPm都为D型,都分离于有严觅PAR症状的猪。关键词:多杀性巴氏杆菌:产毒多杀性巴氏杆菌:PCR;分型:药緻试验中图分类号:S852.6P2文献标识码:A文章编号:0366-6964(2005)0多杀性巴氏杆菌tm山ocida,Pm)是一种重要的病原,可以导致猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。产毒多杀性巴氏杆菌(ToxigenicPasteurellamultocida,T+Pm)是猪进彳亍性萎缩性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)的主要病丿京菌。该病是养猪业的一种重要传染病,其主要表现为:慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩或由于经常打喷嚏而造成鼻出血•。哺乳仔猪感染木病后,除引起鼻中骨哄至鼻腔变形、萎缩或消失外,还可以引起全身钙代谢障碍,致使仔猪发冇迟缓、饲料利用率降低,有时伴发急、慢性支气管炎,导致仔猪死亡。冇肥猪感染木病后,呼吸道的正常结构和功能遭到损害,致使机体抵抗力降低,极易感染其它病原,诸如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪生殖一呼吸道综合征病毒等,引起猪呼吸道综合征,增加猪的死亡率多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A、B、D、E、F5个血清型。硏究表明,VPm主要是D型Pm,而且T+Pm主要分离于具有严重PAR症状的猪,从有肺炎症状猪分离的Pm一般是不产毒素的氏6。T+Pm与TPm在形态特征及生化反应特性上没有区别。与PAR密切相关的T+Pm产生一种约145kDa的皮肤坏死毒素(Dermonecrotictoxin,DNT),该毒素由foxA基因编码。一般认为TPm不会导致PAR,而提纯的DNT可以导致PAR的发生"役所以,DNT是诊断及控制PAR的关键,也是区分FPm与TPm的关键。基于DNT的特性,已经建立了一些检测方法,以区分©Pm与TPm,如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验[⑼、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验[⑴、ELISA⑸。但这些毒素检测方法,无论是动物试验还是细胞培养,操作繁琐,费时费力,在临床上的应用都有很大的局限性⑸。随着T+Pm毒索基因的分了生物学研究,以及近年来PCR检测方法的广泛应用,使T+Pm的检测越来越简便、灵敏和完善。1材料与方法1・1酶及主要试剂____________收稿日期:2004-04-05基金项目:国家自然科学基金项目资助(30471292)作者简介:唐先春(1978-),男,汉,湖北十堰人,硕士,主要从事产毒素多杀性巴氏杆菌方面硏究,E-mai1:xianchuntang@tom.comQ*通讯作者Tel:027-87288629PCR产物/bp鉴定Pm鉴定A型Pm鉴定B型Pm鉴定D型Pm鉴定E型Pm鉴定F型Pm鉴定T+PmKMT1KMT2PmA1PmA2PmBIPmB2PmDlPmD2PmElPmE2PmFlPmF2TAITA2ATCCGCTATTTACCCAGTGGGCTGTAAACGAACTCGCCACGATGCCAAAATCGCAGTCAGTGTTGCCATCATTGTCAGTGCATTTATCCAAGCTCCACCGCCCGAGAGTTTCAATCCTTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCCCATCTACCCACTCAACCATATCAGTCCGCAGAAAATTATTGACTCGCTTGCTGCTTGATTTTGTCTCGGAGAACGCAGAAATCAGTTCCGCCGTCAATTACTCTGCTTAGATGAGCGACAAGGGAATGCCACACCTCTATAG4571048758647512852864TaqDNA聚合酶购fclTaKaRa;生化鉴定管及药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司。1.2病原菌的分离病料来源于海南、湖北、湖南、广东、广西、上海等十多个省市。对于有明显鼻萎缩症状的猪,鼻盘消毒麻采其鼻拭了;部分病料是送检的无鼻萎缩症状的猪以及病肺,无菌采英肺组织。将采集的病料划线接种于胰蛋白大豆琼脂(TrypticSoyA...

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