伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术的建立与优化作者：生秀梅，黄新祥,徐顺高，张海方，许化溪【摘要】目的：建立和优化基于伤寒沙门菌全基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术。方法：提取伤寒沙门菌野生z66阳性菌株总RNA，以6，9核苷酸随机引物（N6、N9）和（或）基因组特异引物（GDP）反转录合成cDNA，用荧光素Cy5或Cy3直接掺入标记后，与包括伤寒沙门菌4201个蛋白编码基因的伤寒沙门菌全基因组芯片杂交，用芯片扫描仪扫描后获得表达谱分析结果，经过数据标准化处理后进行分析。结果：采用N9+GDP混合引物，直接掺入法标记时，既能获得较好标记效果，又能节约试剂成本，同时可减少繁琐步骤所引起的不必要失误。结论：建立的基于伤寒沙门菌基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术，为细菌的基因表达调控及功能基因组学研究提供了平台。【关键词】伤寒沙门菌；基因组；DNA芯片；基因表达谱［Abstract］Objective:TodevelopandoptimizetheSalmonellaentericaserovarTyphigenomicDNAmicroarraybasedgeneexpressionprofiling.Methods：TotalRNAofthez66positivewildstrainsofSalmonellaentericaserovarThypiwasextractedandreversetranscribedtocDNAwithrandomhexaoligonucleotideprimers(N6)，nonaoligonucleotideprimers(N9)andgenomedirectedprimers(GDP).Duringreversetranscription,cDNAwaslabeledwithCy3dyeorCy5dyedirectly.ThelabeledprobeswerepurifiedandhybridizedtoagenomicDNAmicroarrayscontaining4201ORFofS.entericaserovarTyphi.TheimageswereobtainedbyalaserscannerwithtwochannelsandthedigitaldatawereanalyzedbytheAcuity4.0software.Results：UsingN9+GDPprimersanddirectlabelingmethodscouldnotonlyobtaintheexcellentexpressionprofilingresults,butalsocutdownthecostofthereagentandavoidtheerrorscausedbythemultiplesteps.Conclusion：TheSalmonellaentericaserovarThypigenomicDNAmicroarraybasedgeneexpressionprofilingwasdeveloped,whichprovidesaplatformforgenetranscriptionalregulationandfunctionalgenomicsstudies.［Keywords］SalmonellaentericaserovarTyphi;genomicDNAmicroarrays;geneexpressionprofilingDNA芯片技术是20世纪90年代发展起来的一项新颖的分子生物学技术［1］，是各学科交叉综合发展的产物。它以高通量、集约化、大规模、快速平行化等特点，极大地简化和缩短了实验研究进程，目前主要应用于细胞周期、胁迫应答、基因表达调控、基因分型、推测操纵子结构、鉴定毒力因子和遗传药理---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---学研究等方面［2-6］。其中DNA芯片表达谱分析技术是功能基因组研究的热点技术之一［2］。已有很多关于DNA芯片基因表达谱研究的报道，但多集中于真核生物，这是由于真核生物mRNA具有polyA尾，易于获得。原核生物的基因表达谱研究也有报道，但因其mRNA无poly(A)序列等基本特征，只能通过提取总RNA的方式进行相关实验，所以至今没有一个统一的操作方法。沙门菌属（Salmonella）属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），是研究最为广泛和深入的原核生物之一，其基因组结构及近60%的基因功能已被阐明，目前已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌［7,8］。本实验室在伤寒沙门菌现有的全基因组序列已知的基础上成功制备了伤寒沙门菌全基因组DNA芯片［9］。本研究将利用此平台建立和优化细菌DNA芯片基因表达谱技术。常规的DNA芯片基因表达谱分析是通过双色荧光杂交法将参照组和实验组分别用荧光素Cy3和Cy5标记后，与芯片杂交，比较其荧光信号强弱，来获得实验组转录水平上基因表达的差异。整个基因表达谱分析过程比较复杂，包含芯片的制作、RNA的提取、cDNA的合成及荧光素的标记、芯片的杂交与扫描及数据分析等步骤，影响因素众多［10］。因此，本研究利用伤寒沙门菌基因组芯片从RNA的提取、反应体系、RNA用量、反转录酶用量、不同的引物及用量、荧光素用量、cDNA标记及纯化方法、杂交温度及时间等方面对细菌基因表达谱条件进行优...