金线莲挥发油抗人肺癌细胞NCI-H446作用研究林秀钦1杨菁2陈新峰2（1福清市医院药剂科福建福清350300）（2福建医科大学附属协和医院药学部福建福州350001）【摘要】目的探讨福建组培金线莲挥发油对人肺癌细胞NCI-H446增殖能力的影响。方法应用水蒸气蒸憾法提取金线莲挥发油成分，应用透射电镜和DNA-Ladder法检测人肺癌细胞NCI・H446凋亡。结果金线莲挥发油对人肺癌细胞NCI-H446的增殖具有显箸的抑制作用，DNA-Ladder可见明显的DNA-Ladder梯形条带。透射电镜可见细胞质出现明显浓缩，胞质内微绒毛减少，基质逐渐消失，内质网结构出现疏松并与细胞膜融合，并可见凋亡小体。结论金线莲挥发油可抑制人肺癌细胞NCI-H446的牛长。【关键词】金线莲挥发油NCI-H446细胞【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）27-0033-02金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年牛珍稀中草药。金线莲具有消炎、抗癌、抑制胆固醇合成酶活性等多种药理作用，因此被广泛运用于医药、食品、化妆品等行业⑴。目前，对金线莲的研究内容大多集中在分布状况、牛物学特性调查、文献考证、商品调查、成分分析及组培、栽培等方面，对其抗肿瘤作用的硏究报道较少。木课题组前期实验中已提取出金线莲的挥发油成分，并釆用GC-MS法对其成分进行鉴定，共分离出78个峰，确定了其中70种化合物⑵。为探讨金线莲挥发油的抗肿瘤作用及其作用机制，木文研究了金线莲挥发油对NCI・H446细胞的增殖影响，现报道如下：1•材料福建组培金线莲鲜草购自福建医科大学附属协和医院中药房；NCI-H446细胞（由福建医科大学附属协和医院血研所提供）；CO2培养箱（美国ThermoForma公司)。DNA-ladder试剂盒购自碧云天公司。2方法2.1金线莲挥发油的提取将新鲜的金线莲用剪刀剪成约0.5cm长小段，精密称取50g,加适量水溶解，浸泡24h,用挥发油提取器提取15h,合并提取液，加入10ml乙瞇静置过夜，去乙醴层。得到黄色的挥发油，无水硫酸钠干燥，・20°C保存备用，得油率为0.06%。临用前用DMSO助溶，超纯水稀释。2.2透射电镜观察NCI-H446细胞形态取对数生长期的NCI-H446肺癌细胞，接种于6孔板中。次日加80ug/ml的金线莲挥发油及相应溶剂对照的新鲜培养基，24h后，离心收集正常培养和金线莲挥发油处理组的NCI-H446细胞(约l×106个)，加1mL预冷的PBS,混匀，移至EP管。4°C,1000r/min,10min,弃上清，加ImLPBS,4°C,1000r/min,10min再洗一次。前固定：加数滴3%戊二醛4.5%多聚甲醛溶液4°C固定数天；O.lmol/LPBS(pH7.2)漂洗3次。后固定：用1%餓酸5%亚铁氧化钾4°C固定1.5h；0.1mol/LPBS(pH7.2)漂洗3次。70%酒精饱和醋酸铀染液块染，洒精■丙酮梯度脫水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片，厚度80nmo用醋酸铀及柠檬酸铅各染色5min,飞利浦EM208型透射电镜下观察、摄影[21〜22]o2.3DNA■琼脂糖凝胶电泳分析检测NCI・H446细胞凋亡常规培养NCI-H446细胞，细胞经不同浓度(80μg/mLx160μg/mL)金线莲挥发油处理24h后，收集对照组和给药组的细胞，调整细胞数量为5×106个.ml■，按照DNA-ladder试剂盒要求提取DNA。取SulDNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(40V、120min),用凝胶成像系统观察、摄影。3.结果3.1透射电镜观察NCI-H446细胞形态透射电镜下可见，对照组细胞体积较大呈圆形，形态完整，核圆形或椭圆形，核浆比例人，核内染色质自然分布口疏松细致。金线莲挥发油组细胞胞体变圆且形状不规则，形态不完整，细胞电子密度升高，胞浆浓缩，显示细胞有破裂，胞核染色质分布不均呈致密浓染的块状，聚集在核膜的周边，出现颗粒状、环状或新月状的凋亡小体。AB图2透射电镜观察NCI-H446细胞形态(5000×)A：对照组B金线莲挥发油80μg/mLFig.2ObserveNCI-H446withtransmissionelectronmicroscope(5000×)A:ControlgroupB:80μg/mLA.roxburghiiextracttreatedgroup3.2DNA琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡DNA琼脂糖凝胶屯泳结果显示NCI-H446细胞经80ug.ml-和160ugml-的金线莲挥发油处理24小吋后，出现明显的DNA阶梯状条带，且160ug.ml-组阶梯状条带及拖带较SOug.ml-组明显，对照组未见阶梯状条带。图3DNA琼脂糖凝胶电...