新型多靶点药物ZD1839对鼻咽癌细胞CNE2放射敏感性研究陈卫国袁亚维*(南方医科大学南方医院广东广州510515)【摘要】目的:研究ZD1839对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用。方法:采用MTT法测定ZD1839的半数抑制浓度(IC50),克隆形成实验计算细胞存活率，拟合牛存曲线，流式细胞仪检测ZD1839联合放疗的凋亡率及细胞周期分布。结果:单药组，CNE2细胞的存活率ZD1839浓度的增加而降低，其IC50约为2.26&mu;mol/Lo联合组，ZD1839作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用，增敏比为1.529&plusmn;0.135oZD1839或照射均可增加凋亡率，减少S期细胞比例及增加G2/M期细胞比例(P<0.01)o结论:ZD1839联合电离辐射可提高鼻咽癌细胞的放射敏感性，其机制之一可能是ZD1839促进细胞凋亡、干扰细胞周期分布及下调Bcl-2蛋白表达。【关键词】鼻咽癌；CNE2细胞株；ZD1839；放射增敏作用【中图分类号】R739.63【文献标识码】A【文章编号】1008-6455(2010)10-0213-02鼻咽癌病理类型以低分化鳞状细胞癌多见，临床治疗以放疗为主，晚期患者辅以化疗。ZD1839(商品名为Iressa)是一种新开发的可供口服的选择性表皮牛长因了受体酪氨酸激酶抑制剂，其通过小分了化合物竞争结合EGFR酪氨酸激酶催化区的Mg・ATP结合位点，抑制酪氨酸激酶活性，阻断激酶及其底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶的信号转导通路，来达到抗肿瘤目的［门。研究发现对鼻咽癌细胞株CNE2细胞具有明显的抑制作用［2］,但对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响如何？有关报道尚不多见，木实验将ZD1839联合放疗应用于鼻咽癌细胞株CNE2细胞，通过克隆形成实验、流式细胞分析等观察ZD1839的放射增敏作用及其可能机制，以期为临床应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料:ZD1839由英国阿斯利康(AstraZeneca)公司提供，MTT及碘化丙噪(PI)为Sigma公司产品，用PBS液配制成5mg/mL的溶液。AnnexinV■FITC凋亡检测试剂，二甲基亚W(DMSO)购于Sigma公司，RPMIMedium1640为Gibco公司产品。1.2细胞系及培养:鼻咽癌细胞系CNE2由我院肿瘤中心实验室提供；细胞培养在含10%小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的PRIM1640培养液中，置37°C、5%CO2的恒温箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。1.3四甲基偶氮啤蓝(MTT)实验检测IC50:细胞消化、计数，按每孔0.5&times;105细胞均匀接种于96孔培养板,24h细胞贴壁后,将10倍稀释、不同浓度的ZD6474分别加入各孔内，每浓度设5个复孔’并设不加药的细胞对照和空白对照。药物作用72h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20&mu;L,继续孵育4h终止培养,1500r/min离心10min后弃上清，用DMSO150&mu;l溶解沉淀,550nm波长测量吸光度，计算细胞抑制率。抑制率=100%&times;[对照组吸光值(A)—实验组吸光值(A)]/对照组吸光值(A),计算半数抑制浓度(IC50),实验重复3次，计算IC50平均值。1.4克隆形成实验测ZD1839对CNE2细胞的放射增敏作用实验分为3组，①对照组；②照射组(2Gy)；③ZD1839组；④联合照射组。贴壁培养24h。吸出培养液,用药组分别加入终末浓度为IC50的ZD1839的培养基5mL,单纯照射组只加入培养基5mL,继续培养24h。然后立即除去药物，用PBS洗2次。单纯照射组和照射加药组均分别进行照射，照射后置于37°C、5%CO2培养箱内与其他组一起继续培养12d。细胞用100%纯甲醇固定后，吉姆萨染色，并计数。集落形成率(％)二阴性对照组计数的集落数/细胞接种数&times;100%SF(%)二计数的集落数/种植的细胞数&times;集落形成率(％)计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数DO、Dq、N值。最后求放射增敏比(SER),公式如下：SER二单纯照射组D0值比药物+照射组DO值。1.5流式细胞分析1.5.1实验分组:将增殖良好并处于对数生长期的CNE2细胞制成细胞悬液，随机分成4组：(1)空白对照组「单纯培养液培养24h；(2)药物治疗组：加含100&mu;mol/LZD1839；（3）照射治疗组：照射6Gy；（4）联合治疗组：加入含100&mu;mol/LZD1839后；再照射6Gy。1.5.2PI分析细胞周期:收集不同组细胞，70%冷乙醇固定过夜，RnaseA37°C水浴消化30min,PI避光染色30min,上流式细胞仪检测细胞周期分布。1.6统计学处理:采取多靶单击模型拟合细胞存活曲线，并计算出DO。SER的定义...