冬凌草甲素抗多发性骨髓瘤作用机制研究南华大学附一医院血液科，湖南衡阳421001作者简介：罗泽宇：（男，1981年08月-----,）湖南岳阳人，硕士研宄生毕业，现任职于南华大学附属第一医院血液内科）摘要：目的探讨冬凌草甲素（OridoninOri）对多发性骨髓痛（MM）细胞株KM3的抗骨髓瘤效应及可能作用机制。方法经不同浓度冬凌草甲素处理KM3细胞后,MMT法检测细胞增殖抑制率；AnnexinV-FITC/PI染色法检测凋亡细胞的百分率；实时荧光定量PCR检测细胞中BAFF和APRILmRNA表达水平；ELISA检测培养液上清中BAFF和APRIL蛋白的浓度。结果（1）冬凌草甲素以浓度依赖性方式有效地抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，冬凌草甲素抑制KM3细胞活力的IC50为3.8μmol/L；（2）冬凌草甲素以浓度依赖性方式诱导KM3细胞凋亡；（3）冬凌草甲素能抑制KM3细胞BAFF和APRIL的表达。结论冬凌草甲素能有效的抑制多发性骨髓瘤细胞株KM3的增殖，诱导其凋亡；BAFF和APRIL表达的下降可能是冬凌草甲素抗多发性骨髓瘤的重要作用机制。关键词冬凌草甲素多发性骨髓瘤KM3细胞B细胞活化因子增殖诱导配体【中图分类号】R595.4【文献标识码】A【文章编号】1001-5213（2016）08-0443-02冬凌草甲素是从中药唇型科香茶菜属植物冬凌草中提取出来的有效成分，其化学结构是一种二萜类化合物；具有广谱的抗肿瘤作用，目前己被广泛应用于各种实体瘤的治疗。冬凌草甲素对多发性骨髓瘤细胞的作用目前尚少见报道。我们以人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞为模型，通过细胞培养的方法，观察了冬凌草甲素对其生长的抑制作用及诱导凋亡作用，并对其BAFF/APRIL基因的表达水平进行了检测，以期探讨冬凌草甲素对KM3细胞的作用机制，为冬凌草甲素应用于临床治疗多发性骨髓瘤的可能提供可靠的实验依据。材料与方法1.1材料KM3细胞株由上海长征医院血液科候建教授惠赠；冬凌草甲素由中国科学院广州生物医药与健康研宄院周光飙博士惠赠。RPMI-1640粉剂为Gibco公司产品，超级无支原体新生牛血清为Sigma公司产品，MTT购自Sigma公司，AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自BECTONDICKINSON公司；BAFF和APRIL游离蛋白检测ELISA试剂盒购自美国ADL公司;Trizol购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生物工程公司；氯仿，异丙醇，无水乙醇购自湖南师大化学试剂厂；焦碳酸二乙酯（DEPC）购自上海生物工程公司；荧光定量引物根据PCR引物设计原则，参照文献设计BAFF[1]、APRIL[2]和GAPDH引物;其中BAFF和APRIL引物由上海生物工程公司合成,GAPDH引物由广州英韦创津公司合成，引物序列如下：BAFF上游引物为5’-TGAAACACCAACTATACAAAAAG-3’,BAFF下游引物为5’-TCAATTCATCCCCAAAGACAT-3’,预期产物大小为215bpoAPRIL上游引物为5’-TCTGTCCTGCACCTGGTTCC-3’,APRIL下游引物为5’-CAGCAGATAAACTCCAGCATCCT-3’,预期产物大小为174bp。GAPDH上游引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3’,GAPDH下游引物为5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’,预期产物大小为3OObp。KM3细胞培养无菌操作条件下，将KM3细胞接种于含体积分数为10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于5%二氧化碳、饱和湿度、37°C培养箱中进行传代培养，每2-3天换液一次。MTT法取对数生长期KM3细胞，用10%火活的新生牛血清RPMI–1640培养基制成的单细胞悬液，接种于无菌96孔板中,每孔200μl，含5×104个细胞。各实验组加入等体积不同浓度的冬凌草甲素，混匀，使冬凌草甲素终浓度分别为0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L,对照组加等体积DMSO,每组设3个平行孔。将培养板置于37°C，饱和湿度，5%CO2孵箱中常规培养，KM3细胞在培养44小吋后，每孔加入5μmol八的MTT20μl,继续培养4小时。然后2000rpm离心10分钟，小心吸尽上清，每孔加150μIDMSO,振荡至MTT完全溶解，用酶标仪在490nm波长检测A490值（吸光值）。按下式计算细胞生长抑制率并以细胞生长抑制率对药物浓度绘制曲线。细胞生长抑制率（％）=［1-（治疗组A490均值/对照组A490均值）】×100%,取3孔平...