血清蛋白质组学研究中乙月青-异丙醇沉淀法结合2DLC-MSMS的应用吴勇浒韩冉冉黄元姣（通讯作者）（广西医科大学/医学科学实验屮心广西南宁530014）【摘要】目的探讨血清蛋口质组学研究屮高丰度大分子蛋口质的去除方法及其效果。方法利用不同浓度的乙腊■异丙醇处理血清，釆用凝胶电泳和二维液相结合MAILDTOF/TOF-MS鉴定蛋白。结果乙月青■异丙醇沉淀可去除血清中绝大大部分高丰度大分子蛋口质，但蛋口质和多肽丢失失较多，初步的质谱鉴定得出26种蛋白。结论乙月青■异丙醇处理血清有可能为血清蛋白质组学提供简单有效的分析某些蛋白的方法。【关键词】乙睛异丙醇血清2DLC-MS/MS【屮图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）11-0024-02由于疾病发生和发展过程屮患者血清含有表达异常的蛋口质使血清成为研究疾病生物标志的一个重要对象，通过质谱全面动态的分析这些差异蛋白有助于发现与疾病诊断及预后相关的生物标志物及潜在的治疗靶点。蛋白组学的一个重大挑战就是要在像血清、血浆等高度复杂和大动态范围的样品中准确定量蛋白，而潜在的新的标志物极可能是低丰度蛋白或多肽。另外血液组份易受各种因素影响导致个体间差异较大，但目前欠缺简单有效的方法去除高丰度大分子蛋白的干扰，使得比较蛋口组学研究样本难以标准化⑴。本文利用不同浓度的乙睛・异丙醇沉淀处理血清、Tricine-SDS-PAGE和MAILDTOF/TOF・MS分析处理结果，探讨血清蛋白质组研究屮高丰度蛋白质的去除方法，为研究血清蛋白质组和获得疾病相关的血清蛋口标志物打下基础。1材料与方法1.1材料血清由正常人血液获得。实验所用试剂如乙腊、异丙醇、甲醇、乙醇等为HPLC级，购自Merck公司。NuPAGEBis-Tris凝胶购自life公司，强阳离子交换柱(strongcationexchangecolumn,SCX)购自PolyLC公司；MagicC18AQ液相色谱柱购自Michrom公司；Nano-drop2000点靶仪购自Thermoscientific公司；C18spincolumn除盐柱购自TheNestGroup公司；5800PlusMALDI-TOF/TOF质谱仪和ProteinPilot4.0软件购自ABSciex公司。1.2方法1.2.1样本处理将4°C保存的血清5000g离心lOmin,10例血清各取200μl混合均匀作为实验样本。1.2.2去除高丰度蛋白取200ul混合血清与不同比例乙腊或乙腊■异丙醇混合液颠倒混合均匀，冰上静置lOmin,10000g/min离心lOmin,取上清。使用旋转真空浓缩仪4oC20min以去除人部分有机溶剂。1.2.3脱盐及蛋白浓度测定使用Millipore3000MWCO超滤管，经3次50mMTEABbuffer洗脱浓缩至约200μl体积。BCA试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，分装成每管100μg蛋白，冷冻干燥。1.2.4Tricine-SDS-PAGE电泳实验方法参照邓等⑵所述，通过考马斯R250染色结果比较各个比例的处理效果。1.2.5NuPAGEBis-Tris凝胶屯泳实验操作按照制造商说明书进行，电泳条件180V35mino1.2.6蛋白酶解冻干的100μg蛋白样本加入20ulIMTEABbuffer充分复溶,SDS变性、TCEP还原、MTTS封闭后加入5μg胰酶(Promega)37°C消化14h,冷冻干燥。1.2.7离线二维液相色谱分离与点靶酶解后样品用2mlSCXbufferA(lOmMKH2PO4,20%CAN,PH2.7)复溶，上样到SCX柱上,经SCXbufferB(bufferA+lMKCI)梯度洗脫(30min0→15%,5min15→30%,5min30→100%,lOmin100%),收集成2个憾分,冻干。馅分用20〜40ul0.1%TFA复溶，进行反相C18柱梯度淋洗和点靶。1.2.8质谱分析使用5800PlusMALDI-TOF/TOF质谱仪进行，质谱数据采ProteinPilot4.0软件对Uniprot数据库进行检索以鉴定蛋白,以通过5%FDR（FalseDiscoveryRates）验证、UnusedScore>1.3JI至少有1个95%置信肽段为鉴定标准［3］。2结果乙腊处理血清后仍存才大量的高丰度蛋白（图1A）,且处理效果的稳定性较差，多次试验之间去除效果存在差异。相对于乙腊■甲醇、乙月爺乙醇、乙腊■异戊醇，乙月务异丙醇拥有最好的处理血清效果，大部分高丰度大分子蛋白得到去除（图1B）。乙席■异丙醇处理效果稳定，在一定范围内改变乙膳■异丙醇的比例和血清.（乙腊■异丙醇）的比例对于处理效果无明显影响（图2A、B）。通过对各个混合比例的实验比较,确定血清与有机溶剂（乙㈱异丙醇，35:1）在1:1.25比例时拥有较好的去除效果。按照以上实验确定的比...