江苏农业科学2012年第40卷第3期一35一姚晶，吴正钧，任婧．巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展[J]．江苏农业科学，2012，40(3)：35—38巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展姚晶1’。，吴正钧2，任婧1(1．乳业生物技术国家重点实验室／光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436；2．上海海洋大学食品学院，上海201306)摘要：巴氏毕赤酵母表达系统具有优良的特性，是目前广泛应用的微生物表达系统之一，它在理论研究和实践应用上尤其是在大规模发酵中具有重要的意义。本研究综述了巴氏毕赤酵母的生物学和遗传学特性，详细阐述了巴氏毕赤酵母表达系统的组成以及影响外源基因表达的因素，并提出了一些提高表达量的方法。关键词：巴氏毕赤酵母；表达系统；表达；影响因素：Q786文献标志码：A：1002—1302(2012)03—0035—04---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---随着分子生物学理论研究的不断深入，分子生物学技术得到了快速发展，与此同时，构建的不同表达系统也层出不穷。巴氏毕赤酵母(Pwhiapastor括)是1969年由Ogata等首次发现的，并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系统。巴氏毕赤酵母表达系统具有优势的生物学和遗传学特性，和大肠埃希菌(Escherwhmcoli)、酿酒酵母(Saccharo—m，，凹scerev西iae)等传统表达系统一样，被广泛用于外源基因的表达。1巴氏毕赤酵母的特性巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。甲基营养型酵母是指一类可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母菌，主要包括：汉逊酵母属(Hansenula)、念珠酵母属(Candida)、球拟酵母属(％删掣蠡)、克勒克酵母属(K如eck—em)以及毕赤酵母属(Pwhia)等。现研究证实，可作为表达外源蛋白的宿主菌的主要是巴氏毕赤酵母(P．pastoris)和多形汉逊酵母(Hpolymorpha)旧o。甲基营养型酵母的甲醇代谢途径与甲醇氧化机制非常相似，图1为甲醇在巴氏毕赤酵母中的代谢过程睁1，甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中AOX是甲醇酵母代谢途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢，过氧化氢进一步由过氧化氢酶分解成水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶(FMDH)氧化成CO：，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5P)、二羟丙酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟丙酮(DHAP)；DHAP与GAP在1，6一二磷酸果糖醛缩酶作用下形成果糖一1，6一二磷酸(FBP)；FBP又经1，5一二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5P和GAP；Xu5P又一次参加循收稿日期：2011—05一09基金项目：国家“973”计划(编号：2010cB735705)；上海市科委课题(编号：09DZ2251400)。作者简介：姚晶(1987一)，男，江苏宜兴人，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E—mail：yawin905@sina．com。通信作者：任婧，博士，主要从事乳酸菌分子生物学研究。E—mail：叫ing@bnghtdairy．corn。1一醇氧酶；2一过氧化氢酶；3一甲醛脱氢酶；4一甲酸脱氢酶；5～二羟丙酮合成酶；6-二羟丙酮激酶；7—1，6一二磷酸果糖醛缩酶；8一果糖一l，6．二磷酸化酶；9一甲醛还原酶图1巴氏毕赤酵母中甲醇的代谢途径环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。从图1中可以看出，在甲醇代谢途径中，涉及到多种酶，这些酶都是由染色体上的有关基因编码表达的。巴氏毕赤酵母染色体内含有甲醇代谢必需的关键调控酶——醇氧酶(al-eoholoxidase，AOX)基因，它可以产生2种酶——A0x1和AOX2。当葡萄糖、甘油或乙醇等作为碳源时，AOX几乎不表达，进一步研究表明AOX的表达受转录水平调控，强诱导型启动子Paox能有效控制AOX表达H1。最近有研究报道，将顺式元件与原始启动子连接成新型的人工启动子，可以提高外源蛋白的产量和活性”1。此外，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶(pero】【isome)体中，形成区域化：在以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或几个很小的过氧化物酶体；而在以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达怕1。在...