甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度检查方法验证研究摘要：目的：甲磺酸达氟沙星溶液微牛物限度检查方法验证。方法:根据该样品的微生物限度标准，按《中国兽药典》2010年版附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用甲磺酸达氟沙星溶液进行验证试验，以考察确定甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度的检查方法。关键词：微生物限度检查方法；验证；甲磺酸达氟沙星溶液中图分类号：R927.12文献标识码：A文章编号：1006-3315(2013)03-178-001材料：1•供试品：甲磺酸达氟沙星溶液，规格：100ml,批号:1206012•培养基及稀释剂：营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，MUG培养基，麦康凯培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基。PH7.0无菌氯化钠-蛋白豚缓冲液。3•验证用标准菌株：金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］,枯草芽抱杆菌［CMCC(B)63501］,大肠埃希菌［CMCC(B)44102］,白色念珠菌［CMCC(F)98001］,黑曲霉菌［CMCC(F)98003］。上述标准菌株均源自屮国医药细菌保藏中心，验证试验所用的菌株均为第二代。实验部分：1•菌液制备：按照《中国兽药典》2010年版附录要求，采用10倍稀释法稀释，取金黄色葡萄球菌，枯草芽砲杆菌，大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤中30-35°C，培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每lml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基屮23-28°C，培养24-48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每lml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5〜7天，加入3〜5inl含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0・9%无菌氯化钠溶液,将砲子洗脱。然后,用适宜方法吸出砲子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含砲子数50〜lOOcfu的抱子悬液。2•供试液制备：取供试品10ml,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液至100ml,振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。3•细菌，霉菌和酵母菌计数方法验证3.1薄膜过滤法(1)试验组：取1：10供试品溶液10ml,过滤，用PH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液冲洗，每次100ml,冲洗5次,在最后一次冲洗液中加入50-100cfu/ml的金黄色葡萄球菌，枯草芽抱杆菌，人肠埃希菌的试验菌滤〒，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上，置30〜35°C培养3天，每株试验菌平行制备2个平皿，分别加入6个平皿中。白色念珠菌，黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基上，置23〜28°C培养5天，每株菌平行制备2个平皿，计数。(2)菌液组：分别取上述稀释的菌液lml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。(3)供试品对照组:取1：10供试品溶液10ml,过滤,用PH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液冲洗，每次100ml,冲洗5次，以测定供试品的本底菌数。(4)稀释剂対照组：用PH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液替代供试品，加入50-100cfu/ml试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落数计数方法测定其菌数。3・2结果说明：采用薄膜过滤法，试验组金黄色葡萄球菌，枯草芽砲杆菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各试验菌的回收率均高于70%,可采用薄膜过滤法（冲洗量500ml/膜）对木品进行细菌数，霉菌数和酵母菌数测定。4.控制菌检查方法验证4.1大肠埃希菌检查法（1）试验组：取1：10供试品溶液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml,最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液1ml（10-100cfu）,薄膜过滤，取出滤膜，放入100ml胆盐乳糖培养基中，35°C培养24小时，取0.2ml上述培养物加入5mlMUG培养基中，24小时后，加靛基质试液5滴，液面呈现玫瑰环。（2）阴性对照：照上述方法操作，最后一次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液,薄膜过滤，取出滤膜加入50ml胆盐乳糖培养基中，于35°C培养24小时，再取上述培养物划线接种于麦康凯培养基的平板上，于35°C培养24小时,未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。（3）阳性对照组：取人肠埃希菌试验菌液10-100cfu接种至胆盐乳糖增菌培养基，依据大肠埃希菌检查法试验生长良好。4.2试验结果：可采用薄膜过滤法（取1：10供试品溶液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml）对本品进行控制菌（大肠埃希菌）检查，试验组，阳性对照组...