LMX1A基因异常甲基化在胃癌中的研宄冯莉夏景林董文洁赵缜谢蕴上海市闵行区中心医院/复旦大学附属闵行医院上海201199【摘要】目的研究LMX1A基因启动子在胃癌细胞中的甲基化状态.方法运用甲基化特异PCR(MSP)法检测30例原发胃癌和癌旁组织中LMX1A基因的甲基化水平.甲基化修饰后亚硫酸盐测序PCR(BSP)分析胃癌细胞MKN45细胞LMX1A基因启动子CpG岛甲基化状态.提取细胞RNA,通过实时定量PCR(realtime—PCR)检测LMX1A基因mRNA在不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂5’—杂氮一2’—脱氧胞啼陡(5—aza—dC)处理MKN45细胞后,LMX1A基因mRNA的改变情况.结果原发性胃癌的甲基化异常检山率是33%(10/30).LMX1A基因在MKN45细胞中存在高甲基化状态,MKN45细胞经5—aza—dC处理后LMX1A基因mRNA表达明显上调.结论LMX1A基因在原发性胃癌中存在甲基化异常，说明LMX1A基因基因甲基化异常可能参与胃癌的发生.【关键词】胃癌细胞；LMX1A基因；DNA高甲基化；5-aza—dCHypermethylationofLMX1AgeneinhumanGastriccancer【Abstract】ObjectiveTodetectthemethylationstatusofLMX1Apromoteringastriccancercells.Methods30primarygastriccancertissuesandcorrespondingnormaltissuesweredetectedbyMethylation—specificPCR(MSP)method.MethylationstatusofLMX1ApromoterinCRCcelllineMKN45wasexaminedbyBisulfite—sequencingPCR(BSP).ExpressionofLMX1AinMKN45orcellstreatedwithincreasingmountofdemethylationagent,5—aza—dC,wasidentifiedbyRT—PCR.ResultsAberrantmethylationinprimarygastriccancerwas33%(10/30)•HypermethylationofLMX1AwasobservedinMKN45cells.DecreasedLMX1AmRNAcanberestoredinMKN45aftertreatmentwith5—aza—dC.ConclusionsThefreGquentaberantmethylationofLMX1Aisobservedinprimarygastriccancertissues'anddecreasedLMX1AinMKN45cellsissignificantlycorrelatedwith【pKroeymowtoerrdshy】permethylation,suggestingthatpromoterhypermethylationofLMX1Amayplayanimportantroleintumorigenesisofgastriccancer.Gastriccancercancer;LMX1A;Hypermethylation;5—aza—dC【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1008-6315(2015)10—0042—01胃癌是我国常见的肿瘤之一，上海地区的胃癌发生率紧随肺癌和乳腺癌位列第三.-•般认为胃癌的发生与胃的慢性疾病和胃黏膜的上皮异性增生等因素有关,但总的来说其病因未明[1].因此，了解胃癌的发生和发展机理将奋助于胃癌的防治.LMX1A是新发现的转录因子,研究表明,LMX1A基因在宫颈癌中高甲基化，并与病人的预后呈正相[2].LMX1A基因启动子甲基化在胃癌中尚未有报道.本试验通过甲基化特异性PCR(MSP)方法检测LMX1A基因启动子在原发性胃癌的甲基化情况，并通过实吋定量PCR分析胃癌细胞在去甲基化药物处理前后,LMX1A基因mRNA是否出现变化，以探讨启动子甲基化是否参与LMX1A基因的表达调控[3].1材料与方法1.1细胞系MKN45细胞维持在含冇10%胎牛血清的01\^171培养液中,于37(：及5%(：02条件下进行培养.1.2DNA亚硫酸氢钠修饰基因组DNA加入NaOH于42°(3水浴变性30min,再加入亚硫酸氢钠和对苯二酚、混合充分后离心、用石蜡油封层，50"C水浴16—18h.移去石蜡汕，用WizardDNACIean—UpSystem纯化DNA.纯化的DNA加入NaOH,室温放置5-10min.加入乙酸钠和乙醇,一20°C沉淀5h,然后4°C下12000r/min离心30min.室温干燥后50μl火菌双蒸水重新溶解DNA,—20°C保存.1.3甲基化特异性PCR(MSP)用MSP检测TIG在胃癌组织的甲基化状态.反应条件:95°C预变性5min;95°C40s,61°C45s,72°C45S,共40个循环;72°C延伸1Omin.取5μIPCR反应产物，于2%琼脂糖凝胶上电泳，自动电泳凝胶成像分析系统扫描分析.1.4BSP以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板,95°C预变性10min,然后95°C30s,56°C30s,72°C30s,共34个循环，循环结束后继续于72°C延伸10min.反应产物胶冋收后连接到pMD—18Tsimple载体上，选择6个克隆测序.1.55—aza—dC处理细胞分别予1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L浓度5—aza—dC及等量PBS缓冲液处理后，将细胞置于37°C、5%C02、饱和湿度孵箱中培养，...