Rho激酶抑制剂对大鼠脑缺血再灌注后c-jun磷酸化的实验研宄薛松1荣良群2（通讯作者）魏秀娥2张清秀2王凯1张风玉1（1徐州医学院神经精神病学教研室江苏徐州221002）（2徐州医学院第二附属医院神经内科江苏徐州221006）【摘要】目的探讨Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔（fasudil）对核转录因子c-jim磷酸化和蛋Q表达的影响。方法采用四动脉结扎大鼠全脑缺血模型，分为：假手术组、缺血/复灌组、生理盐水对照组和盐酸法舒地尔组，缺血前30分钟腹腔给药，选择c-jun磷酸化高峰的时间点，即缺血/复灌6小时断头、取海马CA1区、匀浆、提核、测蛋Q，采用免疫印迹方法，检测c-jun磷酸化和蛋白的表达。结果盐酸法舒地尔组c-jun磷酸化水平显著低于缺血/复灌组及生理盐水对照组（P<0.05）,对照组与缺血/复灌组之间差异无显著性（P〉0.05）,而对这一时间点的蛋0表达水平无明显影响。结论盐酸法舒地尔可抑制大鼠缺血/复灌诱导的c-jun的磷酸化水平。【关键词】全脑缺血盐酸法舒地尔c-jun海马【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）02-0090-02Rho激酶是小分子鸟苷酸结合蛋白（又称小G蛋白）下游重要的靶效应分子，参与脑血管痉挛、缺血性脑损害及神经轴突生长和神经网络形成等病理生理过程，在神经系统疾病屮发挥重要作用。盐酸法舒地尔属于异喹啉酰胺类Rho激酶抑制剂，主要通过抑制包括Rho激酶等在内的多种蛋白激酶而发挥作用［1］。R前，盐酸法舒地尔己作为一种有效的脑缺血保护剂应用于临床治疗急性脑卒屮,但是具体的作用机制不明。本实验采用全脑缺血动物模型，应用盐酸法舒地尔研究其对c-jun磷酸化及蛋白表达水平的影响，进一步探讨盐酸法舒地尔对脑缺血的作用机制，为临床治疗脑梗死提供了新的靶点。1材料与方法1.1实验动物SD雄性清洁级大鼠，体重220〜300g,购于徐州医学院实验动物中心。1.2主要药品与试剂盐酸法舒地尔（fasudil,天津红日药业提供，批号090116）。兔抗p-c-jun单克隆抗体购自Bioworld公司，兔抗多克隆c-jun抗体购自SantaCruz公司，羊抗兔IgG购自Sigma公司。1.3动物模型制备，4-血管阻塞模型按Pulsinelli等［2】方法进行，腹腔注射20%水合氯醛（300〜3500^/1^＞进麻醉，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。24h后，在大鼠清醒状态下，游离出双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15min，在缺血吋人鼠肛温维持在36.5〜37.5°C。随机分组：①假手术组，手术不缺血；②I/R组，缺血后再灌注6h;③盐酸法舒地尔组，缺血前30min腹腔注射盐酸法舒地尔（15mg.kg-l）,盐酸法舒地尔用生理盐水稀释；（4＞生理盐水组，缺血前30min经腹腔注射相同剂量的生理盐水，术后再灌注6h,每组6例。1.4样品的制备取双侧海马，将其CA1区分离出来，匀浆，力nNP40，，1000g&times;15min于4°C离心，取沉淀加入bufferA,1000g&times;15min于4°C离心，取沉淀加入bufferB,12000g&times;15min于4°C离心移取上清液，置-80°C冰箱待用。1.5蛋白浓度的测定采用改良Lowry&rsquo;s法，以牛血清白蛋白（BSA,fractionV）为标准蛋白。1.6免疫印迹等量蛋白样品经10%SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以半干转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3%BSA封闭后加入稀释后的一抗，4°C过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗（羊抗兔IgG-AP），37°C反疲lh，洗膜，用Odyssey双色红外激光成像系统妇描，结果以Image图像分析软件处理。膜上显示的是各组蛋A的灰度值，以假手术组为基准（假设为1＞,其余各组的蛋白灰度值为与假手术组基准相除所得比值。1.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件数据以均值&plusmn;标准差(x-&plusmn;s)表示，两组间数据比较采用t检验，组间差异用单因素方差分析，P<0.05为冇统计学意义。2结果与假手术组比较，缺血/复灌6h的海马CA1区c-jun磷酸化水平明显增高，而这一吋间点的蛋白表达水平与假手术组相比无明显变化，盐酸法舒地尔组与复灌6h及生理盐水对照比较可显著抑制c-jun的磷酸化水平(见图1)。A图盐酸法舒地尔抑制了缺血/复灌6h海马CA1区c-jun磷酸化高峰的免疫印迹结果；B图盐酸法舒地尔抑制了缺血/复灌6h大鼠海马CA1区c-jun的磷酸化水平的定量分析。与sha...