整合子在鲍曼不动杆菌中的分布与结构分析杨丽萍伊茂礼阎志勇杨丽萍伊茂礼阎志勇(山东省青岛大学医学院山东青岛266000)【屮图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)6-0007-03【摘要】R的了解我院临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子携带情况，以及整合子与鲍曼不动杆菌的耐药相关性分析。方法用VITEK2Compact全自动微生物分析系统及纸片扩散法检测临床分离的鲍曼不动杆菌对常用22种抗生素的敏感性。PCR扩增整合酶基因检测鲍曼不动杆菌携带整合子情况，同时对整合子可变区进行扩增及测序以其了解整合子耐药基因盒携带耐药基因的情况。结果鲍曼不动杆菌呈多重耐药性。鲍曼不动杆菌对CPZ/SB耐药率为1.2%,对替加环素(15.4%)、左旋氧氟沙星(34.4%)、亚胺培南(54.3%)、比阿培南(49.4%)、阿米卡星(59%),对其他抗生素均在71%以上。104株屮有73株菌株含I类整合子(阳性率为70.2%),未有II、III类整合子扩增阳性菌株，且I类整合子阳性株的耐药性均高于阴性株。I类整合子棊因盒序列分析表明我院鲍曼不动杆菌I类整合子携带aacA4、catB8和aadAl3种耐药基因。结论我院分离的鲍曼不动杆菌主要携带I类整合子，丑与多重耐药性密切相关。【关键词】鲍曼不动杆菌整合子整合酶多重耐药性鲍曼不动杆菌导致的多种感染流行或爆发的医院感染在过去10年里已在世界各地包括国内广泛报道，尤其引起医药及微生物学界等的关注［1］。鲍曼不动杆菌已经是常见的医院内感染非发酵革兰阴性杆菌。对几乎各类化学结构各异的临床常用抗生素呈现高度的天然固有耐药性和获得性耐药性使其感染的药物治疗选择极其有限［2,3］鲍曼不动杆菌引起的院内感染及耐药发展趋势值得我们高度关注，为Y解我院鲍曼不动杆菌屮整合子的分布情况及耐药性，对我院2009年4月至2010年1月临床收集的104株鲍曼不动杆菌进行耐药分析及整合子检测与序列分析，进一步探讨整合子与鲍曼不动杆菌耐药关系。1材料和方法1.1菌株来源收集烟台毓璜顶医院2009年4月〜2010年1月住院患者送检标本中分离的鲍曼不动杆菌共104株，菌株均经法国梅里埃公司vitek2Compact全自动微生物分析鉴定系统鉴定。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922,产酸克雷怕菌700630。1.2试剂抗生素药敏纸片、M-H琼脂、肉汤培养基、琼脂糖均购自英国0X01D公司;2×TaqPCRMasterMixDNAsizemarkerII、2500bpDNAsizemarker均购于北京天坛生物科技公司；内切酶Rsa和Hindi均购于大连TAKARA公司；引物合成及PCR产物测序由上海英俊公司完成。1.3药敏试验菌株均经法国梅里埃公司vitek2Compact全自动微生物分析系统革兰阴性菌鉴定卡（GN）鉴定，药敏为GN13药敏卡MIC法检测22种药物（氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢毗肟、头孢替坦、头孢噻利、亚胺培南、比阿培南、替卡西林/克拉维酸、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、替加环素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明）的敏感性；质控菌为产酸克雷怕菌700630,大肠埃希菌ATCC25922。1.4细菌处理挑取纯培养菌落于含奋750ul超纯水的离心管内并充分混匀，95°C水浴20min后，再-2CTC冰浴lOmin。最后20000r/min离心4min，收集上清液，-20°C冰箱备用。1.5整合子及及整合子可变区相关耐药基因盒的扩增PCR反应体系为20μl,2×TaqPCRMasterMixlOμl，lμIDNA模板，lOpmol/L引物各lμl，火菌双蒸水7μl。反应条件：943C预变性5min;循环参数为：94°C变性lmin，56°C退火30s，72°C延伸lmin,共30个循环，最后72°C延伸7min结束。用含溴乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳分析。对整合酶阳性菌株再进行整合子可变区的扩增，扩增整合子可变区循环参数94°C变性4min95°C30s47°C40s72°C2min30个循环。最后72°C延伸10min。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像系统观察电泳结果，并照相。1.6酶切分析取10×Hbuffer2ul，10U/ul的内切酶HinfI和Rsa各lul,整合子可变区PCR扩增产物8ul、dsH2O8u37°C水浴4h,酶切产物用含EB的2%琼脂糖凝胶电泳分析。1.7基因测序整合子可变区扩增产物酶切后电泳条带一致，可认为其具有相同的DNA序列，每一类型选取1〜2株送...