脂肪来源干细胞在软组织填充中的应用研究暴志国张建文王琪影张歌(解放军第153医院整形激光美容外科河南郑州450000)【摘要】目的探讨脂肪来源干细胞在辅助软组织填充中的应用及研究。方法1.利用消化法提取脂肪来源干细胞(ADSCs)收集第3代细胞作为种子细胞。2.实验共分3组:组①ADSCs按50×106个/ml浓度与透明质酸钠凝胶(HA)1:1混合;组②单纯ADSCs配制成浓度25×106个/ml浓度;组③单纯透明质酸钠凝胶。每一样木0.2ml注射到裸鼠(12只,6w雄性)背部皮下，每组各「个点,3个月后分别取材。将获得标木，分别从大体外观、体积、质量、组织学等方面进行分析。结果组①、组②可见有新牛组织形成，组③未见新生软组织形成，Masson三色染色法组①、组②中均可见少量脂肪细胞及胶原蛋白形成。RT-PCR示组①、组②中均见到人类mRNA表达。Westernblot示组①、组②中均可见I型胶原蛋白表达。结论ADSCs+HA可以构建出新生软组织，ADSCs有促进局部胶原蛋白形成的作用。【关键词】脂肪来源干细胞组织工程技术透明质酸钠凝胶胶原蛋白含量【中图分类号】R62【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)46-0028-02如今，一种理想、安全、有效的注射材料的研究也成了整形美容外科一个新的课题。透明质酸(HA)是一种天然的高分子多糖，是一种细胞基质成份，具有非抗原性，不会引起炎症和异物反应，无致敏性、容易获得优点使透明质酸凝胶成为目前应用最为广泛软组织填充剂［1］。应用组织工程技术，选择HA为支架材料,以ADSCs为种子细胞构建种子细胞+支架复合物成了一个新的研究方向。实验将复合材料移植于免疫缺陷的裸鼠体内，观察植入物与宿主之间的相互影响及种子细胞+支架复合物在宿主体内的最终转归，寻找一种更安全、有效、微创的软组织填充方法。1材料与方法1.1试剂II型胶原酶、DMEM培养液、胎牛血清、PBS液、胰蛋白酶、碱性成纤维细胞生长因子、透明质酸钠凝胶。1.2主要器材超生组织匀浆机、纯水系统、恒温C02培养箱、低温台式离心机、精密天平、恒温摇床、倒置相差显微镜、超净工作台、培养瓶、离心管、脂肪抽吸针等。1.3实验动物BALB/cNude裸鼠，12只5w龄，雄性。1.4细胞培养利用消化方法提取ADSCs,DMEM完全培养基培养，取第3代细胞作为实验种子细胞。将ADSCs配置成50×106个/ml浓度备用。1.5干细胞表面标志物鉴定本次试验ADSCs第3代细胞，测定具有干细胞特性的表面标志物CD44、CD49、CD105等，证明具有干细胞特性即可。1.6ADSCs移植实验共分3组:组①ADSCs按50×106个/ml浓度与HA以1：1混合;组②单纯ADSCs,浓度为25×106个/ml;组③单纯透明质酸钠凝胶。按每一-样本0.2ml注射到裸鼠（12只,6w雄性）背部皮下，每只裸鼠背部形成3个点海组各1个点。3个月后取标本，进行检测分析。1.7体积、质量测量以：Lml精密注射器，测量标本体积。精密天平，测量标本质量。1.8Masson三色染色法Masson三色染色法印染标本组织，明确组织成分。读片：胶原蛋白呈蓝色，脂肪呈空泡状，细胞核呈红色。1.9通过RT-PCR测定新生组织染色体ZFXmRAN收集标本组织，超生粉碎使之形成悬浊液，加入细胞裂解液，提取组织RNA、纯化、逆转录，PCR机扩增,琼脂糖电泳凝胶电泳，采用GelDoc2000凝胶图像分析仪采集图片，基因编码区的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。1.10统计分析将数据导入SPSS17.0统计包。应用卡方单因素检验，及LDS行组间差异分析。2结果2.1ADSCS的培养及鉴定人ADSCs在完全培养基DMEM生长状态良好，成单层细胞生长，24小吋内贴壁，刚贴壁细胞成菱形，多边形或三角形，随着生长逐渐形成梭形，纺锤状,细胞排列紧密，呈集落状生长。利用流式细胞仪分选技术，可见ADSCs表面标记物CD44、CD49、CD105均为阳性，说明细胞具有干细胞特性。2.2细胞支架复合物构建结果复合物植入裸鼠背部皮下可见黄豆大小肿块，组中裸鼠生命体征平稳，状态良好，注射局部均无炎症反应。第一周：组①ADSCs+HA组，体积无明显缩小。组②单纯ADSCs组;肿块消失。组③单纯HA组，局部无明显变化。第二周：组①ADSCs按25×106个/ml浓度与稀释后透明质酸钠混合组，体积无明显缩小。组②单纯ADSCs组局部肿块消失。组③单...