P53基因codon72多态性与胃癌及miR375之间关系的研究1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院青海省丙宁市810000【摘要】目的：探讨胃癌与对照组中p53基因第72位密码子多态性的表达及其与miR375之间的关系，以了解两者是否可以联合作为预测胃癌发生的高危指标。方法：采用PCR法检测60例胃癌（高分化10例、中分化19例、低分化31例）、60例正常对照中p53基因第72位密码子多态性及miR375表达。结果：胃癌组中miR375的相对表达量为2.41&plusmn;0.56、正常组为2.76&plusmn;0.39,两者相比，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：p53基因Arg72Pro多态性与胃癌分化程度及miR375表达间无明显相关。【关键词】p53基因第72密码子多态性；miR375；胃癌【中图分类号】R735.2【文献标志码】A【文章编号】2096-0867（2016）-06-340-02胃癌在全球范围内居恶性肿瘤的第4位，病死率居恶性肿瘤的第2位，其是我国最常见的恶性肿瘤之一。P53基因是迄今发现的与人类肿瘤关系较为紧密的基因，几乎在所有的人类肿瘤中均存在P53信号通路。己有研究证明[1],p53基因codon72Arg/Arg基因型可降低胃搞的发病风险，.H.基因型的表达与胃癌的分化程度有关系。miRNA是生物体内重要的非编码小RNA,通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。miR375是定位于致癌基因RAS和p53初始细胞癌变和肿瘤化的关键因子，在牛.殖细胞瘤中起着促进细胞的牛.长和肿瘤形成的作用。新近研究发现[2]miRNA成为p53基因活化后下调某些蛋白表达的重要中间机制。故木研究欲进一步探讨P53基因第72位密码子多态性与胃癌及miR375之间的关系。1材料与方法1.1研究资料收集2014.12-2015.6在青海大学附属医院行胃镜检查并经病理确诊的胃癌患者60例（高分化10例、中分化19例、低分化31例）均未行手术、放化疗，其中男38例，女22例，年龄（41〜82）岁，平均63.51岁。并收取同期正常体检者60例其中男42例，女18例，年龄（38〜78）岁，平均57.48岁。两组间性别和年龄分布经&chi;2检验差异无统计学意义（P分别为0.74、0.87k1.2实验方法1.2.1TaqMan方法检测SNP外周血基因组DNA的提取抗凝采集胃癌组及对照组个体静脉血5mL,转移2mL至EP管，置-80°C冰箱保存，使用柱式血液基因组提取试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）从外周血白细胞中提取基因组DNA,提取的基因组DNA用紫外分光光度计（EppendorfBiophotometer）测定含量并调整浓度后置一20°C冰箱保存。vB.引物及探针的设计与合成根据参考文献［3］及Primer5.0软件设计荧光标记探针及引物。Taqman探针：FAM-CTCCCCGCGTGGCCCC-TAMRAHEX-CTCCCCCCGTGGC-CCCT-TAMRA上游引物：5Z-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3,下游引物：57-GGGCCGCCGGTGTAG-37探针及引物均由生工公司合成。完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler480SoftwareSetup（Roche罗氏）荧光定量PCR仪进行反应。反应条件：50°C预变性2min,95°（?变性100^,95°C变性15s,60°C退火60s，循环40次，再72°C延伸6min。1.2.2荧光定量PCR检测miR375A.microRNA抽提将剩下的抗凝管采集的胃癌组及对照组个体静脉血，转移2mL至EP管，放置在-80°（：冰箱保存，使用柱式microRNA抽提试剂盒（生工公司）提取总RNA，再提取miRNA并将其置于-2（TC冰箱保存。反转录将提取的miRNA至于第一链cDNA合成试剂盒（生工公司）合成第一•链cDNA,并将上述溶液-20&deg;C保存。mircoRNA-375特异性引物序列见下：miR-375RT：57-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACGCGA-3z荧光定量PCR检测P完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler480SoftwareSetup（Roche罗氏）焚光定量PCR仪进行反应。反应条件：95°C变性3min,95°C变性7s，55°C退火10s,再72°C延伸15s,循环40次。1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以均数&plUSmn;标准差（x&plusmn;s）表示，运用配对样本t检验和方差分析;计数资料采用&chi;2检验；计量资料与计数资料间的相关性用spearman分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。2.结果2.1miR375在胃癌组及正常组中的表达胃癌组中miR375的相对表达量为2.41&plusmn;0.56、正常组为2.76&p...