两株高效耐盐菌的分离鉴定及生长特性研究单德鑫李海统黄河等摘要：从大庆不同利用类型的盐碱土地区取土样，经驯化、分离筛选出两株高效耐盐菌，分别命名为A和B。经形态特征观察、生理生化试验、扫描电镜观察和16SrDNA鉴定得知，菌种A为脱氮嗜盐芽孢杆菌（VirgibacillushalodenitrificansstrainDSM10037），菌种B为咸鱼芽孢杆菌（PiscibacillussalipiscariusstrainRBU1-1），均为芽孢杆菌属。经过单因素试验，得出A、B的最适生长条件均为温度30℃，pH7～9，盐浓度20%，这将为以后该地区微生物资源开发利用提供理论依据。关键词：盐碱土；高效耐盐菌；分离；分子鉴定；生长特性：X172文献标识码：A：0439-8114（2014）22-5395-03松嫩平原盐渍土分布十分广泛，是我国盐渍化土壤的最大分布区，其地处半湿润半干旱区，具有广泛的闭流区和矿化度很高的无尾河，年降水量约450mm[1]，该区盐渍土主要分布在平原西部的半干旱和干旱地区，主要包括吉林西部的松原和白城地区，黑龙江的三肇、安达、大庆和齐齐哈尔等地区[2]。其中大庆的盐碱化土地面积为13.69×104hm2，占其土地总面积的28.3%[3]。土壤盐渍化导致大量土壤资源丧失，农业生产条件恶化，严重阻碍了当地农业和农村经济的持续健康发展。因此本试验从大庆盐碱地区取样，分离筛选耐盐菌种，对当地盐碱土中微生物资源状况进行初步探索，为以后该地区微生物资源开发利用提供理论依据，为研发更加成熟的菌剂提供基础和依据。1材料和方法1.1材料分别从大庆的盐碱地区的农田、农田秸秆还田结合区、农田休耕结合区、湖边、碱泡地、石油区取得土样，具体地点如表1所示。培养基的组成如下。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。LB培养基：酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。所有培养基在121℃，0.1Mpa下灭菌20min备用[4]。1.2菌种的分离纯化及筛选将土壤样本分为6组，每组各取0.1g置于100mL三角瓶中，加入50mL蒸馏水，加玻璃珠充分打散，于120r/min摇床中培养3d[5]。各取1mL悬液稀释浓度至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养3d，用划线法纯化培养，然后把已经纯化得到的菌种接种到NaCl浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%和32%的牛肉膏蛋白胨的液体培养基里[6-8]，置30℃下培养，观察生长情况，以确定细菌耐盐程度[9]。参考《常见细菌系统鉴定手册》，通过对菌种进行形态学观察及相关生理生化试验，从而对菌种A、B进行初步鉴定[10]，扫描电镜观察进一步鉴定。而后进行耐盐菌的分子鉴定，即提取菌种的DNA，然后采用细菌16SrDNA的通用引物进行PCR扩增。BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；BSR1510/1492：5′-GGTTACCTTCTTACGACTT-3′。PCR反应体系（50μL）：5μL10×Buffer，4μL2.5mmol/LdNTP，2μLBSF8/27引物（0.1nmol/μL），2μLBSR1510/1492引物（0.1nmol/μL），0.5μLTaq酶（5U/μL），1μL模板DNA，35.5μL双蒸水。反应条件如下：94℃预变性5min94℃变性45s55℃退火90s72℃延伸2min72℃延伸10minPCR反应产物的纯化以及测序由上海生工完成。16SrDNA同源性比较与系统发育学分析将所测得的序列于Genbank上进行Blast比对，利用MEGA4.0软件构建系统发育树[11]。1.3菌种的生长特性研究为研究菌种的最适生长条件，进行单因素试验。1.3.1温度向液体牛肉膏蛋白胨培养基中接入2mL菌悬液，分别在15、20、25、30、35、40℃条件下培养，均做3个平行试验，120r/min振荡24h后，测定培养基内菌液OD值。1.3.2pH将菌悬液分别接入pH为3、5、7、9、12的牛肉膏蛋白胨液体培养基内，其他条件同上，测定24h后培养基内菌液OD值。1.3.3盐浓度将菌悬液分别接入盐浓度为10%、15%、20%、25%、30%的牛肉膏蛋白胨液体培养基内，其他条件同上，测定24h后培养基内菌液OD值。2结果与分析2.1菌种的分离纯化及筛选将取样地样本进行初筛，共获得34株菌。再经富集培养、梯度稀释的菌液涂布于筛选培养基培养，将其纯化后转...