microRNA-21逆向调控RECK促进乳腺癌细胞侵袭转移的研究【摘要】目的研究microRNA-21参与乳腺癌侵袭转移的调控机制。方法采用实时定量反转录-聚合酶反应(RT-PCR)方法检测MDA-435、MDA-231和MCF-7乳腺癌细胞株microRNA-21的表达；采用transwell方法测定上述三株乳腺癌细胞体外侵袭转移能力；人工合成microRNA-21干扰序列，转染MDA-231、MDA-435乳腺癌细胞，观察对细胞侵袭能力的影响；应用Westernblot检测逆转诱导蛋白(RECK)的表达；采用焚光报告基因实验检测RECK与microRNA-21的结合情况。结果MCF-7、MDA-231及MDA-435细胞株中均具有microRNA-21高表达，且表达量MDA-435>MDA-231>MCF-7,其中，具有高侵袭特性的MDA-435细胞具有最高水平microRNA-21的表达为(4.51±0.71)，MDA-231细胞具有中等水平的microRNA-21表达为(2.67土0.27)，MCF-7细胞表达microRNA-21水平相对较低为(1.23±0.11)，比较差异有统计学意义(P【关键词】乳腺癌；侵袭；microRNA-21;伴Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白；RNA干扰DOI：10.14163/j.cnki.ll-5547/r.2016.16.195【Abstract】ObjectiveToresearchregulationmechanismofmicroRNA-21forbreastcancerinvasionandmetastasis.MethodsReal-timequantificationpolymerasechainreaction(RT-PCR)wasappliedtodetectmiR-21expressioninMDA-435，MDA-231andMCF-7breastcancerstrains.Invitroinvasionandmetastasisofthesethreestrainsweredetectedbytranswellmethod.TransfectiononMDA-231andMDA-435cellwasmadebysyntheticmicroRNA21interferencesequencetoobservetheinfluenceoncellinvasion.Reversion-inducingcysteine-richproteinwithKazalmotifs(RECK)proteinexpressionwasdetectedbyWesternblot，andcombinationofRECKandmicroRNA-21wasdetectedbyluciferasereportergenetest.ResultsAllMCF-7，MDA-231andMDA-435strainshadhighexpressedmicroRNA-21，andtheirexpressionvolumewereshownasMDA-435>MDA-231>MCF-7.MDA-435withhighinvasionfeatureshowedthehighestmicroRNA-21expressionlevelas(4.51±0.71followedbymicroRNA-21expressioninMDA-231as(2.67±0.27)andinMCF-7as(1.23±0.11)，andtheirdifferencehadstatisticalsignificance(P【Keywords】Breastcancer；Invasion；microRNA-21；Reversion-inducingcysteine-richproteinwithKazalmotifs；RNAinterferencemicroRNAs是新近识别的人体内一类内源性非编码小分子核糖核酸(RNA)，通过与靶基因互补结合，在转录后水平调控靶蛋白表达，从而参与生物体各项生物学活动。前期研宄显示［1］，microRNA-21在乳腺癌细胞中高表达并与阿霉素耐药有关，并有研宄提示［2］，microRNA-21高表达与乳腺癌患者转移有关。本研宄拟采用RNA干扰技术降低microRNA-21的表达，观察对乳腺癌细胞侵袭转移的影响，并观察对其潜在靶基因：伴Kazal域的富含半胱氨酸的RECK的表达调控。本研究旨在为深入阐述乳腺癌侵袭转移调控机制提供实验室依据。现报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-231和MDA-435由山东省肿瘤防治研究院基础研宄中心常规保存。于含10%小牛血清的细胞冻存培养基（DMEM）中，37°C、5%CO2条件下常规培养。1.1.2主要试剂和仪器脂质体Lipofectamine2000、Trizol试齐I」、实时定量RT-PCR试剂盒、matrigel胶购自美国Invitrogen公司，transwell小室购自美国Coning公司，蛋白提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。RECK和3-actin抗体购于美国SantaCruz公司。定量PCR仪ABI7000购于美国ABI公司。1.2实验方法1.2.1实时定量RT-PCR检测microRNA-21的表达应用Trizol提取细胞RNA。microRNA-21逆转录引物为5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA3’；上游引物为5’GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG3J,下游弓I物为5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’；应用互补脱氧核糖核酸（cDNA）逆转录试剂盒进行逆转录，采用定量PCR试剂盒进行PCR。应用U6RNA的表达进行标准化计算?CT值，重复实验3次，以“均数土标准差”表示。1.2.2细胞转染根据Pubmed数据库中的microRNA-21基因序列，设计合成micro...