IncRNA调控胃癌转移相关miR-7EGFR信号的机制研宄1南平大学附属第二医院消化内科湖南衡阳4210012南华大学附属第二医院肝胆内科湖南衡阳421001第一作者简介：刘艳萍(1980-)，女，湖南邵阳人，主治医师，医学硕士，主要从事消化系肿瘤的防治研究*通讯作者：李国庆，教授，医学博士，主任医师，硕士生导师【摘要】：目的在胃癌组织中筛查参与调控EGFR和miR-7的IncRNA;探索IncRNA、miR-7和EGFR的调控网络作用机制；明确该信号网络在胃癌细胞侵袭转移中的调控作用。方法收集南华大学附属医院3年内经病理证实的胃癌标木200例，检测miR-7和EGFR表达水平改变;观察miR-7和EGFR表达水平与肿瘤分期、分化与侵袭转移的关系，两者之间表达的相关性；筛查参与调控miR-7和EGFR表达的IncRNA。结果观察组与对照组的EGFR蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义(P>O.05)。相比较对照组而言，观察组的miR-7表达阳性率缺失率均较高，组间比较差异具有统计学意义(P<O.05)o结果显示，miR-7与EGFR在胃癌组织中的表达具有相关性，相关系数为0.587。结论IncRNA在恶性肿瘤组织中异常表达的特性，使其成为很好的肿瘤生物标志物，可在肿瘤早期诊断中发挥重要作用。【关键词】••IncRNA；胃癌转移;miR-7/EGFR信号；机制研究【中图分类号】R605.975【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0413-02全球每年新发胃癌934000例，5年生存率不足20%,研宄表明胃癌的发牛.发展、侵袭转移与细胞内信号网络通路异常有关［1】。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)是一类转录讼度超过200nt不含起始和终止密码了•的RNA,因具有较长的一级结构，可作为平台，与其他DNA、RNA相互整合，自身乂能形成复杂多样的二级空间结构与蛋白因子相互作用而发挥牛.物学功能［2］。木项目拟釆用高通量测序技术在胃癌组织和癌旁组织筛查参与调控miR-7/EGFR的IncRNA;并继续扩大临床病例，检测胃癌发生发展过程中EGFR、miR-7和候选IncRNA的表达并分析相互关系；构建上调和抑制候选IncRNA表达的体外细胞模型，揭示候选IncRNA介导胃癌细胞侵袭转移的作用机理。1材料与方法1.1临床资料收集南华大学附属医院2011年6月至2014年6月经病理证实的胃癌标本200例及配对癌旁正常组织。患者术前均未行放、化疗，年龄38-79岁，中位年龄63岁；组织病理类型的判断参照WHO胃癌的病理学分类标准，TNM分期参照UICC/AJCC2002年标准。每例标本留取肿瘤组织及对应的距肿瘤5cm以上的癌旁正常胃黏膜组织（经组织病理切片检测证实），离体后lOmin内置于液氮中保存待做后续分析。1.2试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；DNasel、RNase一free试剂购自美N<IThermo公司；ReverTraAce⑧qPCRRTKit、SYBR~GreenRealtimePCRMasterMix等购自日本Toyobo公司；CCK一8（CellCountingKit-8）细胞增殖/毒性检测试剂盒购自日本同仁研究所；人胃癌AGS细胞购自中科院上海细胞库；ArraystarHumanLncRNAMieroarrayV3.0芯片购自上海康成生物技术有限公司；LncRNAsiRNA和NegativeControl由上海吉玛公司合成；引物由上海英駿生物技术有限公司合成。1.3实验方法1.3.1总RNA的提取取液氮保存的胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。为去除可能污染的DNA,抽提的RNA溶液按DNasel说明书步骤进•一步纯化。采用NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）检测RNA溶液OD260/OD280,计算RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。1.3.2免疫组织法运用10%中性福尔马林对标本进行固定，石蜡常规包埋，制作成4&mu;m切片，常规HE染色，将细胞状态较好的切片作为研究对象。运用SP法对所有标本进行免疫组织化学检测，在同一条件下，严格按照SP免疫组织法对标本进行染色，DAB显色，并将己知的miR-7、EGFR蛋白染色阳性组织切片作为阳性对照组，而PBS取代一抗则为阴性对照。判断标准：随机选取每张切片的5个高倍镜下视野，对细胞染色强度进行仔细观察并记录结果：0分为细胞不着色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。阳性细胞所占百分比与染色强度的乘积结果为最终得分：阳性为得分>3分;阴性为得分&le;3分...