利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

中国人兽共患病学报ChineseJournalofZoonoses文章编号:1002-2694(2011)06-0539-04利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究*赵丽丽',夏强赵秀芹】,万康林"摘要:目的利用PJV53质粒编码的分枝杆茵重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组妥白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩増出sp片段,从质粒PSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5’端非编码区片段AASF5和ss/■基因下游3’端非编码区片段AASF3,利用畫叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3200bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究其定了基础.关键词:重组工程系统;PJV53质粒$串联亲和纯化标签;敲入片段;重叠PCR;耻垢分枝杆菌中图分类号:R378.911文献标识码:AKnockingTAPtaginthegenomeofMycobacteriumsmegmatismc2155bytherecombineeringsysteminMycobacteriumZHAOLi-li,XIAQiang,ZHAOXiu-qin,WANKang-lin(NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention>ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl»Beijing102206»China}ABSTRACT:InordertoknocktheTAPtaginthegenomeofMycobacteriumsmegmatis(M.smegmatis)me2155usingthepJV53plasmidencodingrecombineeringsystem,pJV53plasmidwastransformedintoM.smegmatisme2155tomaketheM.smegmatisme2155expressrecombinantproteinsandpreparetheelectrocompetentcells.ThetapgenewasamplifiedfrompBS1479plasmidandthehyggenewasamplifiedfrompSMT3plasmid.Theaasf(anti-anti-sigmafactor)genew让hAASF5fragment(5-noncodingregionofaasfgene)andAASF3fragment(3*-noncodingregionofaasfgene)wereamplifiedfromthegenomeofM.smegmatisme2155.Thesefourfragmentsweresplicedtogethertoformtheknock-infragmentA5THA3byo-verlapPCR・TheconstructedfragmentwastransformedintotheelectrocompetentcellstomakeitrecombinantintothegenomeofM.smegmatismc:155.TherecombinanteffectwasverifiedbyPCRandDNAsequencing.Theknock-infragmentof3200bpwasgottenbyoverlapPCR.ItwasconfirmedbyPCRandDNAsequencingthattheA5THA3fragmentwithTAPtagwasknockedintothegenomeofM・smegmatisme"155correctly.TheTAPtagwassuccessfullyknockedintothegenomeofM.smegmatisme2155andpavedthewayforfurtherstudyofthefunctionsofsometargetgenes・KEYWORDS:recombineeringsystem;pJV53plasmid;tandemaffinitypurification(TAP)tag;knock-infragment;overlapPCR;Mycobacteriumsmegmatis201b27(6)“重组工程”是近几年兴起的一种新型体内同源重组的遗传工程技术,它是由噬菌体重组酶介导的•国家•十一五”世大传染病防治科技重大专项•结核病传捨模式研究*(2008ZX100/03-010-02)资助通讯作者:万康林.Email:wankanglin@icdc.cn作者单位:1•中国疾病技防控制中心传染病預防控制所/传染病预防控制国家重点实脸室•北京102206,2•南华大学病原生物研究所•衡阳421001体内同源重组,可有效促进线性DNA分子和染色体间的重组,能直接在体内对染色体DNA进行基因敲除、敲入或替换。PJV53质粒⑴是一种大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体,能编码产生Che9c分枝杆菌噬菌体的gp60和gp61蛋白,它们分别是重组蛋白RecE和RecT的同源物,能帮助外来基因序列重组入分枝杆菌,且所参考文献:[l^MichonP・Cole-TobianJL・DabodE.ctal.TheriskofmalarialinfectionsanddiseaseinPapuaNewGuineanchildren[JJ.AmJTropMedHyg.2007.76(6):997-100&[2jGrakouiAtShoukryNH»WoollardDJ,etal.HCVpersistenceandimmuneevasionintheabsence...

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