人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究李学优曹丁肖宏艳黄秀敏甘祥武摘要对重组人溶菌酶真核表达载体的构建筛选、表达与活性鉴定，经过双酶切和测序鉴定表明，重组载体正确。电转化毕赤酵母GWDL菌株，通过G418抗性平板筛选得到高表达高效价菌株，经诱导表达，检测蛋白含量，体外抑菌检测，表达产物15ku和预期结果一致，筛选得到效价为1907U/mL，编号为SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;采用重组人溶菌酶制剂，检测样品GWDL对5种菌的最小抑菌浓度（MIC），藤黄微球菌的最小抑菌浓度较好，表明重组人溶菌酶在毕赤酵母中成功表达，活性较为稳定。关键词毕赤酵母;菌株筛选;高效表达;抑菌活性S188A0517-6611（2020）04-0100-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.029開放科学（资源服务）标识码（OSID）：ExpressionofHumanLysozymeinPichiaPastorisandItsAntibarterialActivityinvitroLIXue-you，CAODing，XIAOHong-yanetal（GuangzhoulnstituteofMicrobiology，Guangzhou，Guangdong510663）AbstractThescreening，expressionandactivityidentificationofconstructedrecombinanthumanlysozymeeukarticexpressionvectorswerestudied.Therecombinantvectorswereshowntobecorrectthroughdoubleenzymedigestionandsequencingidentification.Toelectro-transformthepichiapastorisGWDLstrain，throughG418resistanceflatscreeningtoobtainhighexpressionofhigh-efficiencystrains，theexpressionproduct（15ku）wasconsistentwiththeexpectedresultsafterinducedexpression，detectionofproteincontentandinvitroantisepticdetection，weobtainedNo.SMD1168-pPIC9k-HLZhightiterstrainwithatiterof1907U/mL;TodetectthesampleGWDLminimumbacterialconcentration（MIC）forfivebacteriabyusingRecombinanthumanlysozymepreparation，theminimumconcentrationofmicrococcusluteuswasbetter，indicatingthatrecombinanthumanlysozymeinpichiapastorissuccessfullyexpressed，theactivitywasmorestable.KeywordsPichiapastoris;Strainscreening;Efficientexpression;Antibacterialactivity溶菌酶是小分子碱性蛋白，因其能有效地降解微生物的细胞壁，溶解作用较好，不易产生耐药性，无副作用等优点，被广泛应用于医药制剂、食品防腐等多个行业。溶菌酶可从胎盘中少量提取得到，因提取量较少，有着巨大的应用前景[1-3]。毕赤酵母是一种真核表达菌株，此系统具有稳定性、高效表达、分泌性等特点，可通过甲醇诱导，提高溶氧量，使得菌株效价更高[4-5]。该研究以毕赤酵母为表达系统，重组质粒，经电击转化SMD1168，菌株经G418抗性筛选，对筛选菌株进行诱导表达，加大溶氧量提高表达量，检测活性，得到毕赤酵母的高效表达，以期为后期扩大培养打下基础。1材料与方法1.1材料与试剂大肠杆菌DH5α、pPIC9K质粒、藤黄微球菌、毕赤酵母SMD1168由广东省微生物种质资源库保存。PFUMix、DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、引物、核酸染色剂、琼脂糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司;T4DNA连接酶、限制性内切酶、G418、DNAMarker、ProteinMarker购自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司;cDNA合成试剂盒购自Toyobo公司;重组人溶菌酶标准品购自Sigma公司;琼脂粉购自广州环凯生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器设备生化培养箱，DHZ-DA大容量全温振荡器，752N型紫外可见分光光度计，PCR仪，恒温金属浴，水平/垂直电泳仪，蓝光切胶仪，显微镜，电子天平，pH计等。1.3引物设计与合成根据GenBank上发表的人溶菌酶基因成熟肽序列及表达载体pPIC9k多克隆位点，用DNAstar5.0设计合成引物C1、引物C2，其中引物C1含有XhoI酶切位点（下划线部分），引物C2含有NotI酶切位点（下划线部分），插入序列带有蛋白酶裂解位点，表达的溶菌酶有天然的N端。引物C1：CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTG;引物C2：CTGCGGCCGCTTACACTCCACAACCTTGAACATA。1.4人外周血淋巴细胞总RNA的提取及cDNA模板的克隆收集无菌血样，取5mL（适量肝素抗凝）。将采得的抗凝血在无菌状态下缓慢...