重组腺病毒Ad—GFP—C197的构建及其抗肿瘤活性研究摘要：端粒酶是维持端粒长度的重要组成部分，是肿瘤发生的标志物之一。构建了能表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）C端936-1132氨基酸片段（C197）的重组腺病毒Ad-GFP_C197,并观察其对Hela细胞增殖的影响。结果显示，Ad-GFP-C197感染llela细胞后，采用免疫印迹法检测到C197在细胞内得到高效表达。此外，Ad-GFP-C197明显抑制Hela细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并且降低Hela细胞中端粒酶活性。上述研究为进一步研究hTERTC末端功能打下基础，并为肿瘤的生物治疗提供新的思路。本文采集自网络，本站发布的论文均是优质论文，供学习和研究使用，文中立场与本网站无关，版权和著作权归原作者所有，如有不愿意被转载的情况，请通知我们删除已转载的信息，如果需要分享，请保留本段说明。关键词：重组腺病毒；Hela细胞；人端粒酶逆转录酶；C197；细胞凋亡；端粒酶活性中图分类号：R966文献标识码：A文章编号：W07-7847（2015）03-0237-05端粒是在染色体末端维持染色体稳定的帽状结构，含有特征性的TTAGGG重复片段。细胞每一次分裂均会使TTAGGG片段的丢失，最终导致DNA缺损，引起细胞死亡。端粒酶是一种核糖核蛋白，能特异性地在染色体DNA末端加上TTAGGG片段，防止端粒缩短。绝大多数人体细胞中检测不到端粒酶的活性［1］。与此相反，在85010的肿瘤细胞中检测到了端粒酶活性［2］。端粒酶对肿瘤的发生发展起到重要的促进作用［3］。人端粒酶主要组成部分包括RNA(humantolemeraseRNA,hTR)和逆车专录酉§(humantclom-crascreversetranscriptase,hTERT)。hTR作为模板，在hTERT的作用下使端粒末端得以延长。hTERT有3个结构域，分别是N末端部分，具有逆转录活性的中间部分(逆转录区)，以及一小段C末端序列［4］。N末端主要是与hTR结合部位，C末端主要是与DNA结合部位，这两部分是hTERT与其他逆转录酶的主要区别。逆转录区是催化活性部位，几乎所有的逆转录酶在该区的活性基团都高度保守。目前对hTERT不同片段的研宄较多的是将hTERT的N末端和逆转录区的保守基因进行缺失突变或识别hTERT自然存在的不同mRNA剪切体，观察这些突变体或剪切体对肿瘤细胞增殖的影响和端粒酶活性［5-7］。另外，一些剪切体可以翻译成蛋白质，表现出不同的生理和病理功能，如抑制细胞增殖、抑制Wnt信号途径等端粒外功能［8,9］。目前对hTKRTC末端的研究较少，有研究表明，hTERT的C末端可调节hTERT在细胞内定位［10］，对端粒酶的功能不可或缺［11］。在前期的研宄中，我们曾经构建了表达hTERTC末端197个氨基酸(hTERT936-1132,C197）的真核表达质粒［12］，但表达量不高。在此基础上，本研究构建Y能大量表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197.为进一步研究hTERT的C末端功能打下基础。同时还发现，过表达C197可明显抑制llela细胞增殖，促进其凋亡，降低细胞端粒酶的活性，为肿瘤的生物治疗提供新的思路。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种、细胞系、载体BJ5183、DH5a、HEK293细胞、Hela细胞、重组腺病毒系统AdFJasy-1（包含骨架质粒PAdEasy-1和穿梭质粒PAdTrack-CMV）均由本实验室保存。1.1.2实验试剂和设备胎牛血清、高糖培养基购自美国Hyclonc公司；Sail和EcorV限制性内切酶、T4DNA连接酶、Ex-Tag酶、PmeI酶、Pacl酶均购自美国Thermo公司；小景质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自美国OMEGA公司；Trizol试剂盒购自上海生物技术有限公司;台盼兰试剂盒购自碧云天公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；PVDF膜、TRAP法端粒酶活性检测试剂盒均购自美国Milliporc公司;ECL显色试剂盒购自美国Thermo公司；EB溶液购自美国Sigma公司；6-histag抗体、凝胶成像分析仪（美国Kodak公司）；GDPDH抗体、羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa公司；细胞恒温培养箱（美国Thermo公司）；高速离心机（美国Backman公司）；焚光倒置显微镜（口本Nikon公司）。1.2方法1.2.10的基因获取根据GenBank公布的人hTERT基因序列，选取C端936-1132氨基序列片段（命名为C197），在该片段中的C端引入EcorV限制性酶切位点，在N端引入6个his标签和Sail限制性酶切位点，片段总长度为650bp，合成后克隆至PGSI载体（上海生工...