细胞因子影响G250抗原在肾癌细胞上表达的研究武艺(徐州矿务集团总医院/徐州医学院第二附属医院泌尿外科江苏徐州221006)【摘要】目的研究细胞因子对G250抗原在肾癌细胞上表达的影响。方法运用免疫组化，Western-Blot和半定量RT-PCR技术对IL-2,IFNalpha;,IFNgamma;等细胞因子作用肾癌细胞系786-0,OS-RC-2后G250抗原的表达进行检测。结果细胞因子对两种细胞系上G250抗原的表达有上调作用且与浓度及作用时间呈正相关。结论细胞因子在针对G250抗原的肾癌免疫治疗中可以起到重要的作用。【关键词】G250细胞因子肾癌【】R73-3【文献标识码】A【】2095-1752(2013)28-0050-02肾癌(RCC)是最常见的肾恶性肿瘤，治疗仍以手术为主，放、化疗效果不佳。近十年来，随着对肾癌相关抗原G250研究的深入，针对该抗原的免疫治疗越来越受到重视并被视为治疗肾癌的有效途径。但是肾癌的恶性度越高，G250抗原的表达就越低⑴，针对G250抗原的免疫治疗便难以达到理想的效果。因此，如何提高肾癌特别是高恶性度肾癌G250抗原的表达成为当前的又一新课题。有研究表明，干扰素(IFN)可以上调某些肿瘤相关抗原的表达，为解决这一问题提供了线索。木研究用IL-2,IFNalpha;,IFNgamma;等细胞因了作用于肾癌细胞系786-0,OS-RC-2,初步探讨这些药物对G250抗原在肾癌细胞上表达的影响。1材料与方法1.1：材料1.1.1细胞株G250阳性肾癌细胞系786-0,OS-RC-2购自中科院上海细胞研究所，置于含10%FCS的RPMI1640培养基中，37°C,5%CO2温箱培养。取对数牛长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后备用。1.1.2试剂G250多克隆抗体购自SantaCruz公司，HRP,AP标记的羊抗兔IgG及DAB显色系统购自北京中衫生物科技有限公司，NBT/BCIP显色系统购自上海吉泰---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---生物科技有限公司。TotalRNAIsolationsystem试剂盒，RTAcesssystem试剂盒购自Promega公司。1.2方法1.2.1细胞培养及实验分组取制备好的细胞株786-0,OS-RC-2,分别以2105/ml密度接种于6孔板中（含10%FCS的RPMI1640培养基）。然后分组如下:1：IL-2组，2：IFNalpha;组，3：IFNgamma;组（培养基中终浓度为500IU/ml,1000IU/ml,2500IU/ml,5000IU/ml）和4：对照组,37°C,5%CO2温箱培养。培养时间分别为24h?48h,96ho每组设3复孔。1.2.2G250抗原检测采用免疫组化方法。将1.01.0cm的玻片经防脱片处理后置于24孔培养板中。分组后细胞在终止培养前8h用0.25%胰蛋白酶消化，加入已放有玻片的24孔培养板中，每孔接种3104/ml细胞悬液0.5ml,仍用含有药物的培养基培养。待细胞贴壁后，倒掉培养基，PBS洗涤三遍，4%甲醛固定30mino洗涤，加入G250多克隆抗体，4°C过夜。洗涤，加入HRP标记的羊抗兔IgG,37°C2h,洗涤，DAB显色系统显色。玻片扫描后，计算机分析。1.2.3G250蛋白检测在免疫组化结果显示的最佳浓度和吋间趋势上，采用Western-Blot方法检测细胞株上G250蛋白的表达。实验分组如下：4IL-2组，2：IFNalpha;组，3：IFNgamma;组4：IL-2+IFNalpha;组，5：IFNalpha;+IFNgamma;组，6：IFNgamma;+IL-2组（培养基中终浓度为5000IU/ml）和7：对照组，培养96h。收集终止培养的细胞，超声破碎，Folin酚法测蛋白，调整蛋白浓度为1.5mu;g/mu;L上样40mu;l（含60mu;g总蛋白），电泳后，湿转法将蛋白条带转移至NC膜上。5%脱脂奶粉封闭8h,washing-buffer洗涤三遍，加入G250多克隆抗体，4°C过夜。洗涤，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG,37°C2h,洗涤，NBT/BCIP显色系统显色。NC膜扫描后，计算机灰度扫描分析。1.2.4G250基因检测采用RT-PCR方法。细胞培养及实验分组同Western-Blot方法。细胞总RNA的提取用Promega公司TotaIRNAIsolationsystem试剂盒，具体步骤按试剂盒说明书进行。RT及PCR采用一步法，具体步骤按Promega公司的RTAcesssystem试剂盒说明书进行，其中设计G250上下游引物序列如下：上游5ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCAGGAG3,下游5CCACCGCTCGAGTGAAGCGGCCCGCGCAG3,内参照采用beta;-actin引物序列如下：上游---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---5ACACTATACCCATCTACAAAAAA3,下游5ATGATGGAGTTGAAGGTAGT...