小漿碱增强卵巢癌细胞顺钳敏感性的实验研究罗芳（武汉市普仁医院妇产科430081）【中图分类号】R737.31【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）07-0106-02【摘要】目的探讨小漿碱对卵巢癌细胞顺钳敏感性的影响。方法MTT方法检测细胞抑制率。流式细胞术检测细胞凋亡率。Westernblot检测PDCD4蛋白表达。结果小漿碱增强顺钳对SKOV3细胞增殖的抑制，增强顺钳诱导的SKOV3细胞凋亡，提高PDCD4在SKOV3细胞的表达。结论小葉碱能增加卵巢癌细胞对顺钳的敏感性，有可能成为一种新的卵巢癌治疗药物。卵巢癌是严重威胁女性牛命健康的最常见恶性肿瘤之一。据统计，在牛殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率居第三位，并且有逐年上升趋势，其5年生存率低于45%[l]o目前，肿瘤细胞减灭术后联合多疗程化学药物治疗是卵巢癌的基木治疗原则。因此，化学药物治疗在卵巢癌治疗中占相当重要的地位。治疗过程中肿瘤细胞常常对化疗药物产牛耐药性，使化疗药物的疗效丧失，从而导致化疗失败和肿瘤复发。木研究拟通过体外实验观察小藥碱对顺钳耐药人卵巢癌药物敏感性的影响，并且探讨其中可能的机制，以期利于含小漿碱中药的现代化开发，及为卵巢癌耐药的防治提供新的思路和实验依据。1材料与方法1.1细胞培养人卵巢癌细胞株SKOV-3购自中国科学院上海细胞牛物所。培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素RPMI1640培养液中，置于5%CO2,37°C培养箱中培养。取对数牛长期细胞进行指标检测。1.2细胞体外牛长活性检测采用MTT（四甲基偶氮哇蓝，美国Sigma公司）方法检测顺钳单独作用和顺钳联合小葉碱（美国Sigma公司）作用SKOV-3细胞72h后的吸光度（0D）值。细胞牛长抑制率（％）二[（对照组0D值■实验组0D值）/对照组0D值]&times;100%o1.3流式细胞术检测细胞凋亡消化SKOV3细胞制成细胞悬液,PBS洗2次，用PBS重悬细胞，调整细胞密度l&times;105/mlo一组加入终浓度为2.5mg/L的顺钳;一组加入终浓度为10&mu;mol/L小槃碱和25&mu;g/ml的顺钳。培养24h,预冷PBS洗涤，收集细胞。100&mu;lPBS重悬细胞,PBS洗涤2次”加入5&mu;lAnnexinVFITC和20&mu;l碘化丙唳(PI)溶液,室温避光孵育30min,il4000尼龙网筛，流式细胞仪进行细胞凋亡分析。1.4PDCD4蛋白表达的检测:收集各处理组细胞，裂解缓冲液提取细胞总蛋白'经Bradford法定量后进行SDS-PAGE电泳，电泳上样量为20&mu;g,将电泳后分离的蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC)上。转移后的NC膜采用3%脱脂牛奶封闭30min,室温下于PDCD4一抗中孵育90min；洗涤后，加入二抗室温孵育60min;于ECL(Pierce)试剂中作用lmin,摄片。以GAPDH为内参照,Lab-Work3.0UVP软件分析条带的光密度值。目的蛋白二目的基因条带光密度/GAPDH条带光密度。1.5统计学处理采用SPSS12.0统计软件，计量数据以均数&plusmn;标准差表示。两组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1小槃碱增强顺钳对SKOV3细胞增殖的抑制通过预实验，我们发现小漿碱对SKOV3细胞最大非毒性浓度为10&mu;mol/L。此浓度小槃碱联合不同浓度顺钳作用于SKOV3细胞，抑制率见表1。从表中，可以明显发现，小槃碱增强顺钳对SKOV3细胞增殖的抑制。表1各处理组的抑制率(％)*与不联合小槃碱组比较，P<0.052.2小漿碱增强顺钳诱导的SKOV3细胞凋亡我们采用10&mu;mol/L小菓碱和25&mu;g/ml的顺钳共同作用SKOV3细胞24h,发现细胞凋亡率为3&plusmn;3.9%,明显高于顺钳单独作用组的6.5&plusmn;2.4%(女口图1),说明小漿碱可以增强顺钳诱导的SKOV3细胞凋亡。图1各处理组凋亡率2.3小漿碱提高PDCD4在SK0V3细胞的表达有研究发现，PDCD4表达下降与卵巢癌耐药相关，抑制PDCD4表达可以诱导卵巢癌耐药的发生。本研究通过westernblot方法发现，小槃碱作用后，可提高PDCD4在SKOV3细胞的表达，如图2所示。图2各处理组PDCD4蛋白表达3讨论卵巢癌确诊时多属于中晚期，死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，已成为严重威胁女性生命和健康的疾病之一。化学治疗（化疗）是卵巢癌治疗的重要手段，然而化疗敏感性降低是导致化疗失败的主要原因。近年来，国内外发展了一系列肿瘤耐药逆转剂。从天然植物中，尤其是从传统中药中提取有效成分，已成为耐药逆转研究的热点。小藥碱...